Electroforesis convencional: principios y aplicaciones en biología

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

Contenidos

• Fundamento
• Material para una electroforesis de ácidos nucleicos
• Cámara de EF
• Soporte para las muestras: Gel
• Gel de agarosa
• Geles de acrilamida (PAGE: Polyachrylamide Gel Electrophoresis)
• Buffer
• Marcador de PM (MWM)
• Buffer de carga
• Transiluminador UV
• Tipos de electroforesis
• EF horizontal
• EF vertical
• Procedimiento general de la EF
• Electroforesis de AN
• Adición de las muestras
• Transmisión de la corriente
• Factores que pueden afectar la migración del ADN
• Visualización de las muestras
• Interpretación de resultados
• Aplicaciones de la EF

Fundamento de la Electroforesis

» La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica, cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran; como consecuencia, pueden desplazarse cuando se ven sometidas a un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula.

En la electroforesis hay una migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su carga, PM o tamaño. Este movimiento es generado por la corriente eléctrica.

Los AN: carga - por grupo fosfato (migran hacia el ánodo). Las proteínas en SDS: carga - (migran también hacia el ánodo).

MATERIAL PARA UNA EF DE AN

• » Cámara de electroforesis
• » Soporte para las muestras: GEL
• » Buffer
• » Marcador de PM (MWM)
• » Buffer de carga
• » Transiluminador UV

Cámara de Electroforesis

» Dispositivo que permite la generación de un campo eléctrico alrededor de un gel donde se depositan las muestras.

» El gel se encuentra sumergido en una solución tampón. El campo eléctrico se genera dentro de la solución.

» La solución tampón mantiene el pH estable al paso de la corriente.

» La cámara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía.

Soporte para las muestras: GEL

» Evita perturbaciones mecánicas durante la separación.

» Se usa un gel semisólido compuesto por polímeros que forman una malla o microporos tridimensionales, a través de los cuales avanzan las moléculas según el PM, lo que permite la separación por tamaño de los diferentes componentes de la muestra.

» En las condiciones de la electroforesis, los AN tienen carga negativa, por lo que se separarán en función de su tamaño.

» Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida.

» Para la separación de AN se usan geles de agarosa o acrilamida y para proteínas geles de acrilamida.

Gel de agarosa

Es un polisacárido extraído de algas marinas, que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente, se disuelve a 50-60ºC (líquida) y se solidifica cuando se enfría, formando un gel altamente poroso.

Preparación del gel de agarosa

» Se pesa la agarosa requerida, se disuelve en una solución amortiguadora (tampón) adecuada, de la misma composición y concentración que el buffer de EF y se calienta hasta formar una solución.

» Sin dejar enfriar, se vacía inmediatamente sobre un molde de forma rectangular y en uno de los extremos se coloca un peine para generar los pocillos u orificios donde se colocarán las muestras.

Elección de la concentración de agarosa

» Según el tamaño del ácido nucleico que se vaya a analizar: ADNg (geles menos concentrados: 1%), productos de PCR (geles más concentrados: 2%).

» El tamaño de los poros del gel depende de la concentración de agarosa y ésta es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido.

» A mayor concentración, menor tamaño de los poros, y viceversa, si los poros son pequeños la migración del ácido nucleico es más lenta.

» Los AN con PM alto migran más lentamente que los de menor PM, porque tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa.

» La concentración de agarosa más utilizada para electroforesis de ácidos nucleicos es de 0.5 a 2%.

% de agarosa recomendado	Resolución óptima para el ADN lineal (pb)
0,5	1000-30 000
0,7	800-12 000
1	500-1000
1,2	400-7000
1,5	200-3000
2	50-2000

Geles de acrilamida (PAGE: Polyachrylamide Gel Electrophoresis)

» La acrilamida es un polímero sintético, termoestable, incoloro y químicamente inerte.

» Genera geles con un amplio intervalo de tamaños de poro.

» El gel es el resultado de la polimerización de la mezcla acrilamida - bisacrilamida.

» El tamaño de poro está determinado por la concentración (generalmente en proporción de 19:1).

» Regulando la concentración de ambas y su proporción se consiguen distintas porosidades, siempre menor tamaño de poro que la de los geles de agarosa.

» La acrilamida es una neurotoxina, por lo que debe manejarse con precaución.

» También es esencial almacenarla en un lugar refrigerado, seco y oscuro para reducir la autopolimerización y la hidrólisis.

» El gel de acrilamida soporta mayores voltajes que la agarosa y es susceptible de teñirse por varios procedimientos y puede desteñirse en caso necesario.

» Los geles pueden digerirse para extraer fracciones separadas (bandas) o desecados para su exposición radiográfica y registro permanente.

» La EF en geles de acrilamida se realiza en cámaras verticales.

» La EF de proteínas emplea geles de acrilamida.

Agarosa vs. Poliacrilamida (PAGE)

• » La agarosa no es tóxica.
• » Permite realizar el análisis de AN con PM variados, según la concentración de agarosa que se emplee.
• » Poder de resolución de los geles de agarosa es menor que el de poliacrilamida (PAGE).
• » PAGE se usa para la separación de fragmentos más pequeños y cuando se quiere obtener una mayor resolución.
• » PAGE es más laboriosa de realizar e interpretar.

Buffer o tampón

» El buffer de EF es el mismo con el que se prepara el gel de resolución.

» Proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones, mientras se realiza la EF.

» Para los AN pueden emplearse TBE o TAE.

» Para la PAGE: TBE

• TBE (tris, borato, EDTA)
• TAE (tris, ácido acético, EDTA)

Tris es el nombre abreviado del compuesto orgánico conocido como tris(hidroximetil)aminometano, de fórmula (HOCH2)3CNH2.

Marcador de PM (MWM)

» Son moléculas de ADN que permiten determinar, por comparación, el tamaño de los fragmentos de AN contenidos en las muestras sometidas a EF.

» Están disponibles comercialmente en amplia variedad. Pueden ser:

• fagos o plásmidos, sometidos a corte con enzimas de restricción que generan fragmentos de tamaño conocido;
• o moléculas de ADN sintéticas (escaleras: porque contienen fragmentos con incrementos de tamaño gradual).

Buffer de carga

» Da peso, densidad y color a la muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su salida del gel.

» Permite monitorizar el corrimiento de la muestra en el gel.

» Se emplea en relación 1:3, respecto a la cantidad de muestra.

» Contiene Tris, azul de bromofenol y sacarosa, que da densidad a la muestra depositándola en el fondo del pocillo.

» Azul de bromofenol es una molécula muy pequeña con carga -, que migra al polo + muy deprisa.

» No interacciona con el ADN (migra independientemente de él), por lo que no sirve para visualizarlo.

» Sirve para ver cómo avanza la EF (marca el frente).

Transiluminador UV

» Ilumina la muestra en el gel con luz UV, excitando la molécula cromogénica, que emite energía fluorescente que permite visualizarla.

» Es el sistema empleado con más frecuencia por ser simple y efectivo.

Tipos de electroforesis

• » EF horizontal
• » EF vertical

EF horizontal

Con gel de agarosa, para AN. Se cubre el gel con el tampón para evitar que se seque por el calentamiento inducido por el paso de la corriente eléctrica. · Se carga la muestra en los pocillos:

• en seco: se llena parcialmente la cámara con tampón de EF, de tal manera que la parte superior del gel no se cubra de buffer, para que los pocillos puedan llenarse sin la interferencia del líquido. Una vez cargada la muestra, se corre por unos minutos a bajo voltaje hasta que la muestra entre en el gel y, entonces, se cubre del todo con el buffer de corrimiento.
• EF submarina: la totalidad del gel se cubre con el tampón. La muestra se coloca con el gel sumergido en el buffer.

EF vertical

» Con gel de poliacrilamida, para proteínas o AN de pequeño tamaño.

» El gel está contenido entre dos placas rectangulares de vidrio, donde la corriente eléctrica se genera gracias al buffer en el que se encuentra embebido el gel y llena las cubetas o compartimientos del ánodo y el cátodo.