Técnicas de estudio en Neurociencia, Inmunohistoquímica para Universidad

Técnicas de estudio en Neurociencia

Estudio molecular, celular y estructual de los componentes del sistema nerviosoÍndice

1. Técnicas in vivo
2. Técnicas ex vivo

Técnicas in vivo

Estudios en humanos

Estudios en modelos animales

Técnicas de Neuroimagen

Estructura

Resonancia magnética estructural (iRM): mejor resolución Tomografía computerizada (TAC): peor resolución

Estructura y activación cerebral

No invasivas

Resonancia magnética funcional (RMf)

Invasivas

Tomografía por emisión de positrones (TEP): mejor resolución Tomografía computerizada por emisión de fotón único (SPECT): mala resolución

Técnicas Estructurales

La imagen por resonancia magnética estructural (IRMe) es una técnica no invasiva que permite mostrar en imágenes las regiones cerebrales. La tomografía computerizada (TAC) es una técnica no invasiva que permite mostrar en imágenes las regiones cerebrales, aunque la resolución es peor. Las técnicas estructurales ayuda a los cirujanos a localizar tumores, hemorragias, accidentes cerebrovasculares ...

A 8mm 2 mm P El Baúl Radiológico

Imagen por resonancia magnética (IRM) ¿Cómo funciona?

1. Normalmente, los protones de los átomos de nuestro cuerpo giran en direcciones al azar
2. La resonancia magnética simula un campo electromagnético en donde los protones se alinean
3. Se emiten ondas de radio descolocando la alineación de los protones
4. Los protones se vuelven a alinear emitiendo señales de radio que se graban en un escáner
5. Un ordenador procesa las señales creando una imagen que corresponde a una sección en la parte del cuerpo que se explora

DANTE BARBOSA DO BONFIM Centro de Imagem Diagnostica Achieva 24922 1-July-2015 24-February-1927 12: 10: 48 HR SVI ST 4.00 RT 13.08 L: 1070.00 v: 1860.00 ET 18.58

Técnicas funcionales: Resonancia Magnética Funcional

La imagen por resonancia magnética funcional (IRMf) es una técnica no invasiva que permite mostrar en imágenes las regiones cerebrales activas. Utiliza los principios generales que relacionan estrechamente la actividad neuronal con el metabolismo y el flujo sanguíneo. Una utilidad médica de la IRMf es la de proveer información de la localización de las funciones cerebrales críticas en pacientes que requieren cirugía cerebral. Con esta información, el neurocirujano puede eliminar la mayor cantidad de tejido sin afectar a las funciones cerebrales esenciales. Suele utilizarse para eliminar tumores o corregir epilepsias.

Técnicas funcionales: PET y SPECT

Técnicas invasivas donde se inyecta un marcador radioactivo para estudiar la actividad cerebral. En la tomografía por emisión de positrones (PET) los radiotrazadores generan positrones que se detectan en el escaner. Presenta mejor resolución En la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) se utilizan trazadores radioactivos que se detectan utilizando rayos Gamma. Tiene peor resolución.

b Normal Mild cognitive impairment Alzheimer's disease L b

RMIf: BOLD

Las neuronas necesitan nutrientes para funcionar, pero son incapaces de almacenar contenidos energéticos, dependen del flujo vascular que les entrega nutrientes y oxígeno. Así el incremento regional de la actividad neural está asociado a un incremento local del metabolismo y a la presión de perfusión cerebral. El incremento de la actividad neuronal se traduce en dilatación de lechos capilares con el objeto de proveer un mayor aporte de glucosa y oxígeno al área de actividad neuronal aumentada, aumentando la oxihemoglobina en el lado venoso del lecho capilar, generando ello un aumento de la intensidad de señal.

BOLD (blood oxygen-level dependent) signal Synapse Astrocyte Glutamate Glutamate++Glucose Capillary O2+Glucose 02 Glucose Hb-induced dephasing 1, 1 1, 1 · Less Hb · More Hb Excite - Acquire image · Slower dephasing · Faster dephasing · Stronger MRI signal · Weaker MRI signal MRI emission Tima + Hemoglobina - Señal MRI + fuerte - Hemoglobina Señal MRI + débil

Electrofisiología: ¿ Para qué sirve?

La electrofisiología pirmiete estudiar propiedades eléctricas de células y tejidos biológicos. A nivel neurológico nos permite conocer la función cerebral desde un nivel microscópico, a través del registro de la actividad neuronal individual; hasta un nivel macroscópico mediante el registro de la actividad cerebral al completo. Estos registros pueden hacerse en organismos vivos, tejidos extirpados, células disociadas de tejido extirpado, y tejidos y células desarrollados artificialmente. Como metodo alternativo a esta técnica clasica altamente invasiva, se crearon las técnicas electro fisiológicas ópticas, entre las que se encuentra la electroencefalograma registra la actividad bioeléctrica cerebral.

Electrofisiología: Ejemplos

Electroencefalograma (EEG) Patch clamp www

Electrofisiología: ¿ Como funciona?

La electrofisiología en neurociencia registra la actividad eléctrica de neuronas, y particularmente la actividad de potencial de acción. Este registro se realiza mediante la implantación de electrodos en las proximidades de una neurona (microelectrodo) o una determinada población neuronal (macroelectrodos). La señal eléctrica detectada por el electrodo es muy pequeña y debe ser amplificada. Esta señal también suele tener cierto ruido de fondo que debe ser limpiado. Finalmente la señal es convertida mediante un programa especifico ofreciendo un registro continuo de la actividad neuronal.

Rec. electrode Ground el. Amplifier Reference el. + Stimulator DAAD Convertor

Optogenética: ¿ Para qué sirve?

La optogenética es la combinación de métodos genéticos y ópticos para controlar eventos específicos en ciertas células con una precisión temporal de milisegundos. Este método utiliza la luz como agente inductor que permite excitar o inhibir las células genéticamente modificadas. Por lo tanto, la tecnología optogenética abarca el desarrollo de:

• Proteínas sensibles a la luz (Channelrodopsinas)
• La puesta a punto de estrategias para introducir genes especificos en las células o tejidos diana (vectores)
• La generación de sistemas de lectura capaces de analizar los cambios de comportamiento que se produzcan en la célula del tejido o animal del que se trate (opcional)

Optogenética: ¿ Cómo funciona?

1. Secuenciar la channelrodopsina con un promotor
2. Replicarlo muchas veces
3. Insertarlo en un virus. El virus lo podemos escoger a la carta para que únicamente infecte un tipo determinado de neuronas o podemos infectarlo todo con una construcción que lleve la información para fabricar nuestra channelrodopsina y un promotor que sólo se exprese en un tipo neuronal determinado
4. Una vez que tenemos a nuestro animal expresando la proteína que queríamos y en los tipos neuronales deseados, el siguiente paso será activar esas proteínas implantando al animal, una fibra óptica mediante cirugía estereotáxica, para que llegue hasta la región del cerebro cuya actividad queremos modular
5. El siguiente paso consistiría en conectar esa fibra óptica a una fuente de luz empleando un láser

STEP 1 STEP 2 STEP 3 STEP 4 STEP 5 STEP 6 Piece together genetic construct. Insert construct into virus. Inject virus into animal brain; opsin is expressed in targeted neurons. Insert 'optrode', fibre-optic cable plus electrode. Laser light of specific wavelength opens ion channel in neurons. Record electrophysiological and behavioural results. Promoter to drive expression Gene encoding opsin (light-sensitive ion channel) Light -Membrane Na+ + Opsin channel

Optogenética: Ejemplo

Fiber-Optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue Kevin Ung1 and Benjamin R. Arenkiel1,2,3 1Department of Molecular & Human Genetics, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine 3Jan and Dan Duncan Neurological, Research Institute, Texas Children's Hospital Laser off

DREADDs: ¿ Para que sirven?

DREADDs son las siglas de "Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs". Como su nombre indica estos receptores corresponden a proteínas modificadas que permiten su activación mediante un ligando específico. Los DREADDs más importantes corresponden a receptores muscarínicos modificados, los cuales pierden la afinidad por su ligando endógeno (acetilcolina) y ganan gran afinidad por compuestos sintéticos como la Clozapina-N-Oxido (CNO).

Acetylcholine Acetylcholine Clozapine-N-oxide (CNO) 1 Human M3 muscarinic (hM3) receptor hM3Dq Cell membrane Protein engineering Enhance neuronal excitation Enhance neuronal excitation Su función basica es la de activar o inhibir aquello para lo que se ha diseñado. Estos DREADDs suelen unirse a capsulas víricas modificadas. Así pues, los DREADDs, al ser diseñados a la carta, son muy específicos, teniendo en nuestro poder la capacidad de activar o inhibir, por ejemplo, una población concreta de neuronas de una determinada región cerebral.

DREADDs: ¿ Cómo funcionan?

DNA GFP (hM3/hM4) DREADD CNO given orally or via injection Viral Vector ACh ACh CNO CNO Extracellular Extracellular hM4Di hM3Dq hM4Di hM3Dq Intracellular Intracellular Gi Ga Gi Gq INHIBITION EXCITATION INHIBITION EXCITATION Este método utiliza vectores virales modificados. De esta forma, se inserta el gen que codifica a un DREADD (así como una molécula fluorescente que permite visualizar y localizar su expresión) en un virus. Este virus se inyecta quirúrgicamente en una región del cerebro donde se infectarán las neuronas que posteriormente expresarán el DREADD. La especificidad del tipo celular se puede lograr colocando el gen DREADD bajo diferentes promotores. Fluorescent Tag

DREADDs. Ejemplo

M3 Active Site Catalytic Residues High affinity for Acetylcholine (ACH), the native ligand No affinity for CNO

CRISPR-Cas9

CRISPR viene de las siglas "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats" y Cas9 es una endonucleasa asociada a CRISPR que actúa como una tijera. Es una técnica de edición genética que permite modificar el código genético, alterando, añadiendo o eliminando material genético. Se descubrió gracias a Francis Mojica (Universidad de Alicante), que estudió unas bacterias que podían editar su genoma para mejorar su defensa inmunitaria frente a diferentes virus. Se encontró que estas bacterias tenían dentro de su código genético pequeños fragmentos de ADN de un virus entre unas cadenas repetitivas polindrómicas cortas. A partir de estos fragmentos de ADN se generaban fragmentos de ARN. Cuando el virus volvía a infectar a la bacteria, estos fragmentos de ARN se unían a los del virus y la proteína Cas se encargaba de degradarlos. Convirtiéndose así el CRISPR-Cas en una herramienta genética inmunitaria. Algunos años después, Emmanuelle Charpentier y Jennifer A. Doudna descubren el método para poder utilizar esta técnica para editar el genoma.

Spacer Spacer Spacer Spacer Repeat Repeat Repeat Repeat Repeat Figure 1: Bacterial CRISPR Region.