Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias inmunitario

Técnicas de inmunodiagnóstico

Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias

Unidad 2 U Aplicación de técnicas basadas en reacciones antigeno-anticuerpo secundarias inmunitario Técnicas de inmunodiagnósticoÍndice

Técnicas de inmunodiagnóstico | UNIDAD 2 Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias U

• 2.1. Técnicas de aglutinación directa
• 2.2. Técnicas de aglutinación indirecta
• 2.3. Inhibición de la aglutinación
• 2.4. Pruebas de Coombs directa e indirecta
• 2.5. Técnicas de precipitación
• 2.6. Precipitación en medio líquido
  • 2.6.1. Inmunoturbidimetría
  • 2.6.2. Inmunonefelometría
• 2.7. Precipitación en gel: inmunoprecipitación
  • 2.7.1. Doble difusión
  • 2.7.2. Inmunodifusión radial
  • 2.7.3. Aplicación de campos eléctricos
• 2.8. Técnicas de fijación de complemento
• 2.9. Diagnóstico y seguimiento de las enfermedades infecciosas
  • 2.9.1. Respuesta primaria de anticuerpos
  • 2.9.2. Respuesta secundaria de anticuerpos
  • 2.9.3. Trazado del título de anticuerpos
  • 2.9.4. Utilidad clínica de la detección de anticuerpos
  • 2.9.5. Infecciones que no cursan con elevación de anticuerpos

Introducción a las técnicas de inmunodiagnóstico

Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias

Técnicas de inmunodiagnóstico | UNIDAD 2 Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias Introducción En esta unidad, aprenderemos los fundamentos y la aplicación de técnicas inmunológicas que basan en la interacción entre antígenos y anticuerpos a través de reacciones secundarias (precipitación o aglutinación). Estas técnicas son más sencillas y económicas que las basadas en interacciones primarias, que trataremos en la próxima unidad.

Los primeros cuatro puntos los dedicaremos a las técnicas basadas en la aglutinación, dedicando cada punto a técnicas que se centran en aspectos diferentes de este fenómeno.

Del quinto al séptimo punto, trataremos las técnicas basadas en la precipitación de antígenos mediante anticuerpos, clasifi- cando las técnicas en función del medio utilizado (líquido o gel).

En el penúltimo punto aprenderemos un método poco usado actualmente, pero muy útil en el pasado para diagnósticos, basado en el sistema de complemento.

Para concluir la unidad, nos centraremos en conocer mejor la respuesta del sistema inmunitario ante infecciones, centrándo- nos en la producción de anticuerpos.

Objetivos de la unidad

Al finalizar esta unidad

• Sabremos en qué consisten las técnicas inmunológicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias.
• Conoceremos los conceptos de aglutinación y precipitación mediante anticuerpos.
• Aprenderemos los fundamentos y la utilidad de varias técni- cas basadas en el uso de anticuerpos.
• Seremos capaces de interpretar los resultados de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias.
• Adquiriremos algunas nociones sobre cómo evoluciona la actuación del sistema inmunitario ante infecciones.

( 3Técnicas de inmunodiagnóstico | UNIDAD 2 Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias

Técnicas de aglutinación directa

Fenómeno de aglutinación

2.1. Técnicas de aglutinación directa La aglutinación es un fenómeno que consiste en el agrupa- miento de proteínas o células para formar conjuntos densos que pueden apreciarse mas facilmente que cuando estaban por separado en un a disolución. Los anticuerpos que tienen afinidad por un antigeno tienden a aglutinarse formando complejos reticulares (en forma de red) que podemos recono- cer o medir de manera sencilla.

Las técnicas de aglutinación directa aprovechan esta capacidad de los anticuerpos de unirse a los antígenos para poder evaluar la presencia de antígenos de manera cualitativa. Es decir, que estas técnicas se basan en producir aglutinación mediante anticuerpos para detectar la presencia de antígenos conocidos, pero sin determinar de manera exacta la cantidad presente.

La aglutinación por anticuerpos forma los llamados inmuno- complejos, que son redes moleculares formadas sobre la superficie de los antígenos, que pueden apreciarse a simple vista como cúmulos o gránulos.

Aplicación de técnicas de aglutinación directa

La aplicación de técnicas de aglutinación directa es bastante senci- lla, pues basta con preparar una pequeña porción de la muestra que necesitamos valorar, añadirle anticuerpos y agitar para que la mezcla sea homogénea. Al cabo de un tiempo, si el antígeno está presente, podremos ver precipitados en la disolución.

Para evitar confusiones, es habitual realizar dos mezclas control que nos ayuden a valorar mejor los resultados, una de ellas sin antígeno y otra con una cantidad conocida de antígeno (para asegurar que los anticuerpos funcionan correctamente).

Métodos semicuantitativos en aglutinación

Aunque esta técnica no se considera cuantitativa, se pueden aplicar métodos semicuantitativos como la titulación de anticuerpos. La titulación consiste en determinar la concen- tración mínima de anticuerpos para la que se produce aglutinación, que nos da una idea de la concentración de antígenos en la muestra a pesar de no ser una cantidad exacta.

Es habitual que estas valoraciones se realicen en placas de microtitulación, que cuentan con varios pocillos donde podemos disponer las mezclas ordenadamente y valorarlas más fácilmente.

Aplicaciones clínicas de aglutinación directa

Ente las aplicaciones clínicas más habituales destacan la detección de parásitos en sangre y, sobre todo, la determi- nación de grupos sanguíneos utilizando anticuerpos contra los antígenos de membrana de los eritrocitos.

Como probablemente ya sabemos, existen 4 tipos principales de grupos sanguíneos (A, B, AB y O) y paralelamente, también otro marcador que es el Rh (puede estar presente o no).

En las pruebas de aglutinación, aprovecharemos que cada grupo sanguíneo reacciona de una manera diferente ante diferentes anticuerpos:

A AB Grupo sanguíneo (sistema ABO) Anticuerpos Presencia de Rh + Anti-A + Anti-Rh » A - » Rh + » B - >> No Rh - » O- » AB + + Anti-B » A - » B + » O - » AB + + Anti-Rh « 4Técnicas de inmunodiagnóstico | UNIDAD 2 Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias

Técnicas de aglutinación indirecta

Fundamento de la aglutinación indirecta

2.2 I Técnicas de aglutinación indirecta La base de esta técnica es la misma que en la anterior, pues también se pretenden detectar inmunocomplejos. La diferen- cia está en que los antígenos se unen previamente a la superficie de partículas portadoras inertes (normalmente latex) a la acción de los anticuerpos.

Esto facilita la aglutinación, debido a que los antígenos quedan más cercanos entre sí y los inmunocomplejos formados son más grandes y fáciles de apreciar.

A la hora de aplicar esta técnica, veremos que las mezclas que contienen el portador y los antígenos tienen un aspecto lecho- so, que adquiere una textura más transparente y con grumos cuando se produce aglutinación.

Hemaglutinación indirecta

Una variante de esta técnica muy utilizada en hospitales es la hemaglutinación indirecta, que utiliza los glóbulos rojos como portadores, en lugar de partículas de látex.

Aplicaciones de la aglutinación indirecta

En cuanto a aplicaciones se refiere, estas técnicas se utilizan para detectar antigenos presentes en cantidades reducidas durante infecciones o para detectar autoanticuerpos (anticuer- pos generados contra antígenos del propio organismo).

Partícula de látex Antígenos th + (Incubación) Suspensión lechosa Anticuerpos del suero problema Y Y Complejos antígeno-anticuerpos apreciables como agregados Imagen 1. Mecanismo de aglutinación indirecta 5Técnicas de inmunodiagnóstico | UNIDAD 2 Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias

Inhibición de la aglutinación

Principio de la inhibición de la aglutinación

2.3 Inhibición de la aglutinación El principio en el que se basan estas pruebas es el opuesto a las anteriores, ya que lo que se valora es la ausencia de aglutinación cuando se añaden anticuerpos.

El procedimiento en estos casos parte de obtener una muestra de suero en la que sospechamos que existe la presencia del agente aglutinante (un virus, por ejemplo) y se añade a dos preparaciones diferentes, una de ellas con glóbulos rojos y otra que además de glóbulos rojos contenga anticuerpos contra el agente.

Si hay presencia de un agente aglutinante, se producirá agluti- nación en la preparación de glóbulos rojos solo, pero no en la que contenía anticuerpos, ya que estos bloquearán este efecto.

Uso de la técnica de inhibición de la aglutinación

Esta técnica se utiliza para la detección de patógenos concretos, entre los que destacan algunos tipos de virus como el de la gripe.

La aglutinación de los glóbulos rojos en sangre puede ser muy peligrosa si bloquea los vasos sanguíneos 1 6Técnicas de inmunodiagnóstico | UNIDAD 2 Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias

Pruebas de Coombs

Aplicación clínica de las pruebas de Coombs

2.4. Pruebas de Coombs directa e indirecta Esta prueba es muy empleada en el ámbito clínico, ya que se aplica para determinar si existe una respuesta inmune contra el feto en pacientes embarazadas que son Rh- y que están gestando individuos Rh+.

En estos casos, existe la posibilidad de que el organismo de la madre detecte los glóbulos rojos del feto como una amenaza y desarrolle una respuesta específica contra ellos. Esta respues- ta puede producir abortos por lo que es recomendable realizar estas pruebas si el padre es Rh+.

Los anticuerpos anti-Rh no producen aglutinación, por lo que para detectarlos es necesario recurrir a métodos específicos que pueden ser de dos maneras:

Método directo de Coombs

MÉTODO DIRECTO MÉTODO INDIRECTO 1 SUERO MATERNO Y 1 Ig. Anti-Rh SANGRE FETAL ERITROCITOS RH- Ig. Anti-Anti-Rh Aglutinación Directa Detección de anticuerpos anti-Rh en la superficie de los eritro- citos del feto o recién nacido. Para ello se realiza una centrifugación de una muestra de sangre fetal que permita separar los glóbulos rojos del suero (lavado) y, posteriormente, se incuban estos con anticuerpos específicos contra los anticuerpos anti-Rh (anti-anti-Rh). Si el resultado es positivo, se producirá aglutinamiento y por tanto existe riesgo de aborto.

Método indirecto de Coombs

Indirecta En este caso se toma una muestra de sangre de la madre y se eliminan los componentes celulares. A la muestra obteni- da se le añaden se le añaden glóbulos rojos Rh+. Tras esto se procede como en el caso anterior, añadiendo anticuerpos contra los anti-Rh que estarán unidos a los glóbulos rojos en caso de que el resultado sea positivo. Si se produce aglutina- ción, el resultado será positivo.

Diagnóstico de patologías con pruebas de Coombs

Además de aplicarse para detectar el riesgo en embarazos, esta prueba también se aplica para el diagnóstico de otras patologías como anemias hemolíticas, reacciones postransfusionales, leucemia linfoide crónica o mononucleosis infecciosa.

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