Técnicas inmunológicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias

Técnicas inmunológicas

Introducción a las técnicas inmunológicas

Recordemos que los antígenos son sustancias capaces de estimular el sistema inmunitario y provocar una respuesta dirigida específicamente contra ellos. Los antígenos tienen zonas llamadas epítopos, que son las zonas a las que se pueden unir los anticuerpos. Los anticuerpos son un grupo de proteínas globulares llamados inmunoglobulinas (lg) producidos por los linfocitos B y las células plasmáticas que tienen la capacidad de unirse específica a ciertos antígenos, mediante sus centros de unión.

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En esta unidad, vamos a ver las técnicas más representativas de las técnicas que se basan en las reacciones secundarias: la aglutinación y la precipitación.

En esta unidad también se estudian las proteínas que forman el sistema complemento, así como las diferentes vías de activación del complemento. Se analizan las enfermedades causadas por la deficiencia genética de uno o varios componentes del sistema de complemento. Los tipos y técnicas de fijación de complemento.

Objetivos de la unidad

Al finalizar el estudio de esta unidad, habrás alcanzado los siguientes objetivos:

• Conocer el fundamento de las reacciones de aglutinación.
• Identificar los distintos tipos de reacciones de aglutinación que pueden producirse.
• Interpretar los resultados de este tipo de reacciones.
• Reconocer la importancia de este tipo de técnicas en el diagnóstico clínico.
• Conocer cómo se realizan algunas técnicas de aglutinación comerciales.
• Conocer el fundamento de las reacciones de precipitación.
• Identificar los distintos tipos de reacciones de precipitación que pueden producirse.
• Interpretar los resultados de este tipo de reacciones.
• Reconocer la importancia de este tipo de técnicas en el diagnóstico clínico.
• Saber cómo se realizan algunas técnicas de precipitación comerciales.

. Conocer los elementos que componen el sistema complemento.

• Comprender sus mecanismos de actuación.
• Identificar las distintas vías de activación del sistema.
• Entender cómo se realizan las técnicas más utilizadas para evaluar su función.

Técnicas inmunológicas

Las técnicas inmunológicas son aquellas que se basan en la extraordinaria especificidad ejercida entre un antígeno y un anticuerpo.

Las uniones antígeno-anticuerpo son específicas: cada anticuerpo se genera en respuesta a un antígeno determinado. Esta especificidad tiene muchas aplicaciones en el laboratorio clínico, ya que permite detectar la presencia de un anticuerpo si se añade el antígeno correspondiente, o a la inversa.

Cuando se ponen en contacto un antígeno y un anticuerpo específico contra él, reaccionan y se origina un complejo antígeno-anticuerpo (inmunocomplejo), mediante una unión reversible.

Cuando esta reacción se produce in vitro, podemos diferenciar dos fases: la reacción primaria no visible y la reacción secundaria que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparición de un fenómeno visible a simple vista

De esta forma las reacciones antígeno-anticuerpo se pueden clasificar en:

• Reacciones antígeno-anticuerpo primarias. La formación de inmunocomplejos no induce ningún cambio físico en el medio, por lo que hay que recurrir a la detección de algún tipo de señal emitida por un compuesto (marcador) que previamente se ha unido de forma covalente a uno de los componentes de la reacción. En general, las técnicas que emplean marcadores, como las reacciones de inmunofluorescencia y, especialmente, las inmunoenzimáticas (unidad de trabajo 5), son sensibles y específicas. Su principal limitación es la necesidad de equipamientos, como el microscopio de fluorescencia o el espectrofotómetro, que encarecen los ensayos.
• Reacciones antígeno-anticuerpo secundarias. La formación de inmunocomplejos induce un cambio físico en el medio, formando un precipitado, una aglutinación o un cambio de la turbidez, etc. Estas técnicas son más sencillas y de menor coste.

Reacciones de aglutinación

Concepto de aglutinación

Las reacciones de aglutinación se producen entre partículas que están en suspensión. Generalmente, es el antígeno el que está presente en la superficie de las partículas (aglutinógeno) y se enfrenta a un anticuerpo específico que lo aglutina (aglutinina).

Imagen 2. Reacciones de aglutinación

El aglutinógeno debe estar presente en la partícula de forma apreciable, y debe estar situado en la superficie. Además, debe poseer múltiples epítopos, es decir, varios sitios de unión al anticuerpo.

Las aglutininas completas son los anticuerpos que siempre producen aglutinación, mientras que las incompletas son las que, a pesar de reaccionar con el antígeno, no producen una aglutinación cuando están en situación desfavorable. Por su tamaño y multivalencia las IgM son aglutininas completas, mientras que las IgG son incompletas por ser bivalentes.

Para que la reacción de aglutinación se produzca correctamente, es preciso que la concentración del aglutinógeno no sea excesiva respecto a la aglutinina y viceversa. En caso contrario, si existe un desequilibrio entre las cantidades de los componentes de la reacción se produce un fenómeno de zona y se obtiene un resultado falso negativo.

Cuando existe un exceso de anticuerpos respecto a la concentración de antígeno, no se produce aglutinación visible, este desequilibrio se conoce como efecto prozona. Del mismo modo si se produce un exceso de aglutinógeno respecto a la concentración de anticuerpos se conoce como efecto postzona y tampoco se produce la aglutinación. Para evitar estos errores, conviene diluir los sueros convenientemente para alcanzar una concentración de aglutinógenos-aglutinina equivalentes y apreciar una reacción positiva correcta.

Otro factor que influye en la reacción de aglutinación es la temperatura. La mayoría de las reacciones se producen de forma correcta a temperatura ambiente (20 ℃) los aglutinógenos bacterianos reaccionan mejor con su aglutinina a 37 °℃ incluso algunas aglutininas reacciona de forma óptima con su antígeno a 4℃ (crioaglutininas).

Tipos de reacciones de aglutinación

Hay dos formas de realizar técnicas de aglutinación: de forma directa o de forma indirecta.

Aglutinación directa

Las pruebas de aglutinación directa o activa son aquellas en las que la aglutinina reacciona con un aglutinógeno presente de forma natural en la superficie de un tipo de células. Tras esta reacción, se forma un puente de unión entre dichas células, produciendo la aglutinación de las células recubiertas de antígeno o a las partículas inertes que son portadoras pasivas de antígenos solubles.

Un ejemplo de prueba de este tipo es la que se produce cuando se pone en contacto hematíes del grupo A con suero anti-A.

Para facilitar la aglutinación, cuando se utilizan anticuerpos incompletos, se emplean tres estrategias:

1. Aumentar la viscosidad del medio con albúmina, dextrano o polivinil pirrolidina.
2. Eliminar ácido siálico de la membrana celular con enzimas como la tripsina, papaína, o bromelina.
3. Reducir la fuerza iónica que rodea a las células (LISS: Low lonic Strength Solution).

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Aglutinación indirecta

Las pruebas indirectas o pasivas son aquellas en las que la aglutinina reacciona con un aglutinógeno que ha sido transferido pasivamente a la superficie de una célula o partícula inerte.

Un ejemplo de esta aglutinación es la aglutinación que se produce al poner en contacto un suero problema, que contiene aglutininas anti-toxoplasma, con hematíes de cordero que han sido recubiertos con aglutinógenos procedentes de un lisado de toxoplasma.

EL proceso mediante el cual las partículas son recubiertas de aglutinógenos que no son propios, se denomina sensibilización. Si las partículas utilizadas son vitales, es decir son células, pueden ser fijadas mediante sustancias como la formalina para su almacenamiento durante largos periodos de tiempo.

Para facilitar la sensibilización, hay dos sistemas:

• Exposición: exponer a las células a la acción de algunas sustancias, como el ácido tánico, que favorece la adsorción del aglutinógeno a la superficie celular.
• Moléculas bifuncionales: emplear moléculas bifuncionales como la bencidina nitrogenada que se fijan a la superficie celular, y luego unen el aglutinógeno de forma covalente.

Imagen 4. Aglutinación indirecta. Esquema de la aglutinación indirecta.

Una prueba especial de aglutinación indirecta es la aglutinación inversa, en la que el aglutinógeno está libre en la muestra problema y reacciona con la aglutinina que está fijada a la superficie de la partícula.

Ejemplo de esta aglutinación inversa es la que se produce al reaccionar el Ag de superficie de la hepatitis B (HBs-Ag) contenido en el suero problema, con una suspensión de partículas de látex recubiertas de anticuerpos anti-HBs-Ag.

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Soportes para la aglutinación

Las reacciones de aglutinación pueden llevarse a cabo en portaobjetos de cristal, en tarjetas visualizadoras, en placas de microtitulación (microtitter) y en el interior de tubos de ensayo.

Portaobjetos

Portaobjetos: en portaobjetos se realiza la determinación de grupo sanguíneo. El resultado positivo se observa por la aparición de grumos en la zona de mezcla de los hematíes del paciente y las aglutininas o antisueros para cada grupo estudiado.

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Tarjetas visualizadoras

Tarjetas visualizadoras: las tarjetas visualizadoras son de material plástico y en ellas están impresos unos círculos coloreados de forma que haya buen contraste con la partícula empleada. Si esta es blanca, el círculo es negro, o si la partícula es oscura, el círculo es blanco. El resultado positivo se observa por la formación de grumos en alguno de los círculos, mientras que el negativo se verifica por una mezcla homogénea de los reactivos.