Fissazione dei tessuti, HPV e carcinoma della cervice uterina: un'analisi approfondita

La Fissazione nella Preparazione Istologica

La fissazione è il primo e fondamentale passaggio nella preparazione di un campione istologico per l'osservazione al microscopio. Il suo scopo principale è preservare la struttura e la composizione chimica dei tessuti, evitando fenomeni di degradazione post-mortem e autolisi cellulare. Questo processo consente di mantenere le caratteristiche morfologiche e biochimiche del tessuto il più vicino possibile a quelle dello stato vivente. La fissazione ha diversi scopi principali:

1. Prevenire l'autolisi: dopo la morte cellulare, gli enzimi intracellulari iniziano a degradare il tessuto. I fissativi denaturano questi enzimi, bloccandone l'azione.
2. Impedire la putrefazione: i batteri e i funghi possono decomporre il tessuto. Il fissativo uccide tali microrganismi.
3. Mantenere la struttura: i fissativi stabilizzano i componenti cellulari e della matrice extracellulare, impedendo modifiche morfologiche.
4. Preparare il tessuto per le fasi successive: Dopo la fissazione, il tessuto deve resistere alla disidratazione, inclusione e taglio senza perdere la propria integrità strutturale.
5. Mantenere i componenti biochimici: Alcuni fissativi preservano proteine, lipidi e acidi nucleici per studi istochimici o immunoistochimici.

Metodi di Fissazione

Esistono diversi metodi di fissazione a seconda dello scopo dell'analisi:

a) Fissazione fisica > Consiste nell'utilizzo di agenti fisici per bloccare la degradazione del tessuto.

• Congelamento rapido: viene usato per studi enzimatici o immunoistochimici. Il tessuto viene congelato in azoto liquido o con il metodo del freddo secco.
• Essiccazione: utilizzata per preparati citologici, come strisci di sangue o midollo osseo.

Fissazione con il Criostato

➢ Fissazione con il Criostato: la fissazione con il criostato è una tecnica che prevede il congelamento del tessuto seguito dal taglio di sezioni sottili in un ambiente a bassa temperatura. Si tratta di un Congelamento progressivo sulla piastra refrigerata del criostato (-20°C/-30℃). Questo metodo viene utilizzato principalmente per studi istologici, immunoistochimici ed enzimatici, poiché preserva le strutture biologiche senza introdurre alterazioni chimiche. Il criostato è un apparecchio costituito da:

• Camera refrigerata: mantiene temperature comprese tra -20℃ e -30℃, impedendo la degradazione del tessuto.
• Micrometro di precisione: permette di ottenere sezioni con spessori variabili tra 5 e 50 um.
• Portacampione (chuck): una piastra metallica su cui viene fissato il tessuto.
• Lama di taglio: solitamente in acciaio o in carburo di tungsteno, progettata per tagliare tessuti congelati senza deformarli.

È fondamentale l'utilizzo di crioprotettori (es. OCT, glicerolo, DMSO). Il tessuto viene immerso in un mezzo crioprotettivo per ridurre la formazione di cristalli di ghiaccio. L'OCT (Optimal Cutting Temperature Compound, è una resina) è uno dei più usati e consente un miglior ancoraggio al supporto del criostato.

Fissazione Chimica

b) Fissazione chimica > I fissativi chimici interagiscono con i componenti del tessuto, formando legami crociati che stabilizzano la struttura. Fissativi chimici principali:

1. Aldeidici (creano legami crociati con le proteine):

• Formaldeide (4% o 10%) / Formalina tamponata al 10%: È il fissativo più utilizzato in istologia. Mantiene bene la morfologia e permette colorazioni immunoistochimiche.> Glutaraldeide (2-3%): Utilizzata per la microscopia elettronica, stabilizza anche i lipidi e le membrane cellulari.

1. Coagulanti (precipitano proteine e mantengono le strutture cellulari):

• Alcool etilico (50-100%): Usato per fissare campioni citologici e per colorazioni rapide come Papanicolaou e Giemsa.
• Metanolo e acetone: Usati per preparati ematologici o congelati. Preserva bene antigeni e lipidi.

1. Composti ossidanti:

• Acido osmico (OsO4): Impiegato in microscopia elettronica per fissare le membrane cellulari.

1. Fissativi misti (combinano diverse proprietà):

• Bouin: Composto da formalina, acido picrico e acido acetico. Ottimo per colorazioni particolari, ma non adatto per studi molecolari.
• Zenker e Helly: Contengono mercurio, formaldeide e altri agenti. Utilizzati per studi istologici speciali.

Procedura di Fissazione

a) Raccolta del Campione: il campione deve essere prelevato rapidamente dopo l'espianto per evitare fenomeni di autolisi e putrefazione. Il volume del fissativo deve essere almeno 10 volte superiore al volume del tessuto per garantire una penetrazione omogenea. b) Tempo di fissazione: dipende dal tipo di tessuto e dal fissativo utilizzato:

• Formaldeide: 6-24 ore per una fissazione ottimale.
• Glutaraldeide: 1-4 ore per la microscopia elettronica.
• Alcool e acetone: Agiscono più rapidamente (15-30 minuti).

c) Modalità di fissazione

• Immersione: Il campione è immerso direttamente nel fissativo (metodo più comune).
• Perfusione: Iniettato attraverso il sistema circolatorio (usato in ricerca su animali da laboratorio).
• Fumigazione: Applicata a preparati citologici mediante vapori di formalina.

Effetti Collaterali della Fissazione

Retrazione del tessuto: Alcuni fissativi (es. alcool) causano disidratazione e restringimento del tessuto. Perdita di antigeni: Alcuni fissativi denaturano le proteine, compromettendo l'uso di tecniche immunoistochimiche. Modificazione della morfologia: Acidi forti come l'acido picrico possono alterare la struttura cellulare. La fissazione è un passaggio cruciale nella preparazione dei campioni istologici. La scelta del fissativo dipende dallo scopo dell'analisi e dalle caratteristiche del tessuto. Un protocollo ben eseguito garantisce la preservazione ottimale delle strutture cellulari e molecolari, consentendo analisi accurate sia in istologia classica che in tecniche avanzate come la microscopia elettronica o la immunoistochimica.

La Colorazione dei Campioni Istologici

La colorazione è un passaggio fondamentale per visualizzare le strutture cellulari e tissutali al microscopio. Poiché molti componenti biologici sono trasparenti, l'uso di coloranti specifici permette di evidenziare nuclei, citoplasma, fibre connettivali, lipidi, carboidrati e altre strutture. I meccanismi con i quali i coloranti si legano ai costituenti dei tessuti sono sicuramente molteplici e in gran parte sconosciuti. Tuttavia, alcuni dei più importanti coloranti istologici formano legami elettrostatici, di tipo salino, con radicali ionizzabili delle macromolecole tipo proteine, acidi nucleici etc. Perciò, i coloranti sono fondamentalmente classificati in due categorie:

• Coloranti acidofili (ematossilina, tionina, pironina, azzurro B etc).
• Coloranti basofili (eosina, orange G, verde luce etc.)

Colorazioni Standard o Generali

Colorazioni Standard (o Generali): utilizzate per evidenziare la morfologia generale dei tessuti.

Ematossilina-Eosina (H&E)

➢ Ematossilina-Eosina (H&E): la più comune, colora il nucleo in blu/viola e il citoplasma in rosa. È una colorazione dicromica e combinata. Sfrutta due coloranti con affinità per diverse strutture cellulari:

• Ematossilina: basica colora le strutture acide (come il DNA) in blu/viola.
• Eosina: acida, colora le strutture basiche (proteine citoplasmatiche) in rosa/rosso.

1. Deparaffinizzazione e Reidratazione (se il campione è in paraffina)

• Immersione in xilene per rimuovere la paraffina.
• Passaggi in alcool a concentrazione decrescente fino all'acqua distillata.

1. Colorazione con Ematossilina

• Il campione viene immerso in una soluzione di ematossilina (spesso di Harris o Mayer).
• Il tempo varia da 1 a 10 minuti, a seconda dell'intensità desiderata.
• Dopo la colorazione, il vetrino viene lavato in acqua corrente per differenziare il colore.

1. Bluing (Viraggio dell'Ematossilina)

• Il tessuto viene trattato con una soluzione basica (come acqua di rubinetto o ammoniaca diluita) per trasformare l'ematossilina in una forma insolubile che conferisce un colore blu intenso.

1. Colorazione con Eosina

• Il campione viene immerso in eosina per 30 secondi - 2 minuti.
• L'eosina colora il citoplasma, il collagene e i globuli rossi in rosa/rosso.

1. Disidratazione e Montaggio

• Il campione viene passato in serie alcoliche crescenti, poi in xilene.
• Infine, viene montato con medium e coprivetrino per la conservazione.

1. Risultati

• Nuclei -> blu/viola (ematossilina).
• Citoplasma e fibre muscolari -> rosa (eosina).
• Collagene -> rosa pallido.
• Globuli rossi -> rosso intenso.

Azan-Mallory

➢ Azan-Mallory: evidenzia il tessuto connettivo in blu e i muscoli in rosso. L'Azan-Mallory è una colorazione tricromica che distingue bene i diversi componenti del tessuto:

• Azocarmine: colora i nuclei in rosso.
• Anilina blu o arancio G: colora il collagene in blu intenso e il citoplasma in rosso/arancione.Applicazioni: studi sul tessuto connettivo (fibrosi, infiammazioni croniche); Identificazione di collagene e fibre muscolari; analisi della matrice extracellulare.

Colorazione di Van Gieson

> Colorazione di Van Gieson: questa colorazione usa una combinazione di acido picrico e fucsina acida per distinguere il collagene dal muscolo e dal citoplasma. Colorazione con Ematossilina di Weigert per evidenziare i nuclei; trattamento con soluzione di Van Gieson (acido picrico + fucsina acida); lavaggio, disidratazione e montaggio. Risultati della Van Gieson

• Collagene -> rosso intenso.
• Citoplasma e muscoli -> giallo.
• Nuclei -> nero/viola.

Colorazioni Speciali

Colorazioni Speciali: utilizzate per evidenziare specifici componenti tissutali.

PAS (Acido Periodico di Schiff)

➢ PAS (Acido Periodico di Schiff): colora i polisaccaridi e mucine in rosso-viola. La colorazione PAS (Acido Periodico di Schiff) è una tecnica di colorazione istologica utilizzata per evidenziare la presenza di polisaccaridi, glicoproteine e mucopolisaccaridi in diversi tessuti. Questa colorazione è particolarmente utile per lo studio di strutture come membrane basali, glicogeno, mucine e funziona come marker per alcune patologie. La colorazione PAS si basa sulla reazione tra l'acido periodico e i gruppi alcolici primari e secondari presenti nei polisaccaridi (come il glicogeno e le mucine). L'acido periodico ossida questi gruppi alcolici, creando un'aldeide. Successivamente, queste aldeidi reagiscono con il reagente Schiff, che colora le aldeidi di rosso-violaceo. Risultati della Colorazione PAS

• Strutture colorate di rosso/violaceo:
• Glicogeno: presente nel citoplasma delle cellule, come nelle cellule epatiche e muscolari.
• Mucopolisaccaridi: come le mucine nelle ghiandole e nell'epitelio.
• Membrane basali: evidenziate soprattutto nelle strutture epiteliali, come nell'epit. renale.
• Glicoproteine: come quelle presenti nelle mucose e nei tessuti connettivi.
• Strutture non colorate: Nuclei (se non contracolorati) e altre strutture cellulari.

La colorazione PAS è una tecnica estremamente utile per lo studio dei polisaccaridi, glicoproteine e mucopolisaccaridi. Le sue applicazioni vanno dalla diagnosi delle malattie metaboliche al riconoscimento di mucine in tessuti tumorali, fino all'analisi delle membrane basali e del glicogeno.

Altre Colorazioni Speciali

> Tricromica di Masson: distingue collagene (blu o verde), citoplasma (rosso) e nuclei (blu scuro o nero). > Reticolina: evidenzia le fibre reticolari in nero. > Sudan III e Oil Red O: colorano i lipidi in rosso: la colorazione cito/istochimica OIL RED-O è utilizzata per evidenziare i lipidi, sostanze solubili in solventi non polari e dunque insolubili in acqua. Questo colorante fa parte della categoria dei lisocromi, un gruppo di sostanze liposolubili che hanno la capacità di sciogliersi nelle molecole lipidiche trasmettendo loro la propria colorazione. Al microscopio i lipidi risulteranno di colore rosso-arancione, mentre i nuclei saranno di colore blu, grazie alla contro colorazione con ematossilina. La colorazione viene richiesta quando si sospetta la presenza di cellule contenenti lipidi. Per esempio, in tumori mesenchimali di sospetta derivazione adipocitica (liposarcomi). Oppure può essere utile per confermare l'accumulo di lipidi all'interno di cellule durante processi degenerativi/dismetabolici, come nella lipidosi epatica. La colorazione può essere eseguita su prelievi citologici essiccati all'aria o su pezzi istologici. Questi ultimi però non possono essere fissati