FPLC e elettroforesi: principi, strumentazione e applicazioni

FPLC: Cromatografia Liquida Veloce per Proteine

FLPC -> FAST PROTEIN LIQUID CROMATOGRAPHY E' una strumentazione meccanica, una cromatografia su colonna in fase liquida e viene utilizzata per purificare da una miscela eterogenea delle proteine . È una strumentazione utilizzata a scopi qualitativi e quantitativi , a scopi preparativi oltre che analitici. Il materiale viene caricato in una colonna ed è sufficiente da essere eluito in una quantità adeguata per caratterizzare la molecola. Quando abbiamo di fronte l'estratto grezzo e vogliamo purificare la proteina, posso purificarla proprio con FPLC perché ottengo una discreta quantità.

Caratteristiche e Svantaggi dell'FPLC

FPLC utilizza colonne in teflon , più resistenti del vetro e di piccole dimensioni. Le particelle della fase stazionaria non sono cosi piccole e questo porta lo svantaggio di non avere molti piatti teorici e quindi lo scambio tra le due fasi è minore e la risoluzione è bassa.

Vantaggi Operativi dell'FPLC

Il vantaggio è quello di poter lavorare a pressione leggermente più elevate rispetto a quelle atmosferiche ma non di molto perché le particelle sono più grandi e non resistono cosi tanto al flusso della fase mobile ed in più il sistema di pompe è meno potente perché non deve spingere moltissimo la fase mobile all'interno della fase stazionaria.

Componenti dello Strumento FPLC

Lo strumento è fatto da un blocco principale costituito dal sistema di pompe che sono due A e B e che possono lavorare insieme o separatamente. Le pompe possono portare una certa pressione sul liquido, sulla fase mobile , che entra nella fase stazionaria ma senza arrivare a livelli esagerati di pressione. È sempre presente un raccoglitore di frazioni giallo che contiene una serie di buchi dove vengono inserite le provette ed è importante perché raccoglie ciascun tipo che esce dalla colonna cromatografica per poi ottenere tante provette quanti sono i picchi della cromatogramma ottenuto. Il cromatogramma è visibile sullo schermo del computer oppure può essere stampabile ed esiste una parte piccolissima che è la colonna di FPLC dove è presente un sistema di iniezione, il sistema di pompe che sta a monte dell'iniettore, della colonna cromatografica, del rivelatore e del raccoglitore di frazioni . Il liquido viene spinto dai contenitori nella fase mobile ,attraverso l'iniettore dove c'è il campione lo recupera , lo porta in colonna e poi viene fatta l'analisi con il rivelatore che segnerà un cromatogramma e ciascun picco verrà raccolto .

Elettroforesi: Principi Fondamentali

ELETTROFORESI Che cos'è l'elettroforesi ? Qualsiasi molecola che si sposta all'interno di un campo elettrico ( termine generale ) Il campo elettrico viene generato da due elettrodi con differenza di potenziale ( anodo e catodo ) ; deve essere presente la corrente e si usa, quindi, un elettrolita che contiene sale e che conduce la corrente da un polo all'altro, dal catodo all'anodo e viceversa. Quindi deve essere presente un contenitore che prende il nome di cella elettroforetica che deve essere piena di tampone ( chiamato tampone per elettroforesi) e che ha loscopo, essendo un elettrolita forte , di condurre la corrente attraverso il catodo - e l'anodo + che si trovano all'interno del contenitore e dove viene stabilita una differenza di potenziale. Le molecole , cosi, si spostano all'interno del campo elettrico a seconda della loro carica e c'è chi andrà verso l'anodo se è carico negativo e chi verso il catodo se è carico positivo .

Supporto per la Migrazione Elettroforetica

Questo spostamento di molecole nel campo elettrico avviene su un supporto, posto tra i due elettrodi , in cui corrono spinte dal campo elettrico. Il supporto è del tutto inerte ed ha soltanto lo scopo di sostenere la corsa delle molecole che corrono nella fase liquida del supporto . Il supporto è di varia natura, organica o inorganica ma riesce ad impregnare del liquido che è la fase liquida. Qui Le molecole si spostano sempre in base alla loro carica .

Velocità di Migrazione delle Molecole

Il campo elettrico è generato da un generatore ed è indicato con il simbolo E ed imprime una certa velocità di migrazione indicata con V alle molecole cariche indicate con la lettera q . Al variare del campo elettrico varia anche la velocità di migrazione delle molecole e le molecole si muovono più velocemente . Le molecole, però, devono essere cariche e la spinta è data dal prodotto del campo elettrico per la carica (E x q = forza di spinta) Le molecole che possono essere utilizzate nell'elettroforesi sono tutte quelle dotate di carica per cui, qualsiasi molecola dall'amminoacido , peptide, oligopeptide etc e questo perché in soluzione hanno un certo Ph.

Fattori che Frenano la Corsa Molecolare

Cosa potrebbe frenare invece la corsa della molecola ?

• Peso molecolare
• viscosità del mezzo
• forma delle proteine ( fibrosa o globulare ) dove quella più impedita è la fibrosa
• porosità del mezzo

le proteine più grandi subiscono una forza frenante maggiore, sono le più impedite a correre e quindi subiscono rallentamento il supporto è una sorta di reticolo , i suoi pori possono essere piccoli o grandi e quindi limitare o meno lo scorrimento.

Formula della Velocità di Migrazione

La velocità di migrazione ( v) della molecola dipende dalla forza che spinge la molecola e da quella che la trattiene : la molecola si muove tenendo conto di queste due forze. Nella realtà la forza di spinta è sempre maggiore rispetto alla forza che trattiene / frenante . Possiamo ricordarci questa formula che è la velocità di migrazione di una molecola che è v= E x q / f f = coefficiente frizionale che tiene conto delle 4 cose che ho elencato sopra Da questa formula si evince che la velocità elettroforetica è direttamente proporzionale a E x q e diversamente proporzionale alla forza frenante .Nella realtà ogni proteina è associata non tanto alla velocità di migrazione ma più alla mobilità elettroforetica e quindi ad ogni proteina è associata una velocità che dipende dalla velocità di migrazione e dal campo elettrico se sostituisco v= E x q / f / E = £ x q/ f x 1/E =q/f che è la mobilità elettroforetica che dipende dalla carica e dalla forza frizionale p = q/f

Limitazioni nell'Aumento del Voltaggio

Prima abbiamo detto che se voglio far muovere le molecole più velocemente posso aumentare il campo elettrico e quindi si pensa che a questo punto dell'elettroforesi sparo il voltaggio a 200 e l'analisi , di conseguenza , sarà velocissima e le molecole correranno rapidamente perché sottoposte al campo elettrico e se poi, magari non ho molto tempo sparo il voltaggio a 1000. Nella realtà non funziona cosi' perché non posso permettermi di aumentare la differenza di potenziale di molto per via della legge di OHM che dice che l'intensità della corrente elettrica I è direttamente proporzionale al voltaggio per cui decido che voglio andare a 100 volt piuttosto che 200 o 300 , aumento la corrente e di conseguenza aumenterò anche la velocità delle molecole e la rapidità dell'analisi . Peccato , però, che la legge dica che il voltaggio sia direttamente proporzionale alla resistenza che, a sua volta, è direttamente proporzionale alla potenza che dissipa calore e che porterebbe a riscaldare il supporto cromatografico denaturando le proteine causando evaporazione della soluzione tampone con conseguente concentrazione degli ioni e rallentamento della velocità di migrazione . In tutto ciò aumenterebbe anche la temperatura ed oltre i 25-30 ℃ non posso condurre una elettroforesi e quindi devo usare un voltaggio molto basso con analisi che vengono fatte in tempo breve ma si tratta sempre di un'ora .

Supporti Utilizzati nell'Elettroforesi

I supporti che vengono utilizzati sono tre

• Acetato di cellulosa
• Agarosio
• Poliacrilammide

Tutti e tre i supporti sono di natura inerti , non reagiscono mai con il campione e devono essere imbevuti all'interno del tampone per elettroforesi . E' il tampone per elettroforesi che, impregnando il supporto, fa si che le proteine si spostino lungo le maglie del supporto in direzione del campo elettrico

Acetato di Cellulosa nell'Elettroforesi

ACETATO DI CELLULOSA : supporti inerte , viene ancora utilizzato come tipo di elettroforesi per la diagnosi di alcune patologie e viene usata per la separazione delle proteine plasmatiche , del siero . Sono strisce bianche ed è un materiale lucido, vengono venduti in pacchetti da 100 pezzi e ciascun foglietto può contenere un po' di campioni . Sono abbastanza flessibili e si impregnano con il tampone per elettroforesi ed , appunto, viene utilizzato ancora oggi per l'analisi delle proteine plasmatiche . In molti ospedali l'analisi delle proteine plasmatiche viene fatta in HPLC o con altre tecniche mentre in laboratori più piccoli viene utilizzato l'acetato di cellulosa.Viene presa la striscia di acetato e viene messa nella vaschetta elettroforetica che è piena di tampone. Il tampone è un elettrolita forte e la striscia di acetato di cellulosa viene posta tra i due elettrodi, tra l'anodo e catodo. La vaschetta è piena di tampone con Ph 8-8,5 perché tutte le proteine hanno una carica e variando il Ph varia la carica delle proteine portando anche a non avere l'elettroforesi di alcune . Poi l'operatore semina uno o due elettroliti di siero sulla membrana microcellulosa , in prossimità del catodo perché le proteine plasmatiche a PH 8,3 hanno una carica positiva e si spostano versi l'anodo che è negativo ( ad eccezione dell'albumina che ha ph 8,3 ed ha carica negativa e si sposta verso il catodo ). A questo punto viene acceso il voltaggio 6-8 volt ( voltaggio basso ) e si fa l'elettroforesi per circa 3 ore ; alla fine delle 3 ore si toglie la striscia dal supporto, la si fa asciugare e vengono colorate immergendole in un opportuno colorante . Dal colorante usciranno con il colore rosso di diverse intensità e laddove c'è una banda di colore rosso significa che è presente una proteina o una classe di proteine . Tanto più è rosso e tanta più proteina ho perché il colorante si lega molto di più . Nel disegno che avevamo visto il rosso intenso era per la presenza di albumina ed infatti è la proteina plasmatica più abbondante , e poi ci sono le alfa1 , alfa 2, beta e gamma immunoglobuline che hanno diversi ruoli e corrono verso l'anodo. La alfa hanno Peso molecolare maggiore , sono più grandi rispetto alle gamma, e fanno fatica a correre e si separano in base alla velocità che dipende , appunto , dal loro peso molecolare . Tanto più grandi sono tanto più fanno fatica a correre mentre tanto più piccole sono e tanto più facile sarà per loro correre Ad esempio le alfa 1 sono più grandi delle alfa2 ed hanno mobilità elettroforetica inferiore . Le beta sono più grandi delle gamma e dipendono dal loro peso molecolare ed anche loro hanno mobilità elettroforetica inferiore. Alla fine, siccome l'intensità del colore è proporzionale alla concentrazione delle proteine , si fa l'analisi per valutare la quantità delle proteine plasmatiche dove l'elettroferogramma converte l'intensità di colore in un picco ; è uno strumento che fa la foto alla lastra di acetato di cellulosa e li trasforma in intensità, in pixel, convertendolo poi in picchi . Quando ci sono in corso condizioni non fisiologiche ma patologiche i picchi possono modificarsi ed essere più bassi o più alti .

Agarosio nell'Elettroforesi

AGAROSIO : Viene utilizzato poco per le proteine ma viene usato per l'analisi degli acidi nucleici, DNA e RNA perché gli acidi nucleici contengono nella loro molecola dei gruppi fosfato carichi negativi che si muovono sempre verso il polo positivo ( catodo ) Non sono disponibili dei gel di agarosio già fatti perché deve essere fatto al momento o il giorno prima. È un gel perché ha la consistenza gelatinosa ed è abbastanza rigida da poterla lavorare.