Maturazione Rna e splicing: modificazioni terminali e ruolo degli introni

Maturazione RNA e Splicing

data 29/04/24 | sbobinatori: Giorgia Di Maio fino a pag 7, Ilaria Di Rauso a seguire Integrazione sulla trascrizione mettendo in luce cose sorvolate le volte precedenti: La RNA polinerasi così come la DNA polimerasi ha attività di proofreading, è in grado di correggere gli errori che fa durante la trascrizione, cioè quando incorpora un nucleotide non correttamente appaiato con lo stampo. L'efficienza di questo passaggio è inferiore rispetto alla DNA polimerasi; questo è dovuto al fatto che la RNA polimerasi non utilizza come substrato un primer correttamente appaiato col suo stampo, per la DNA polimerasi invece questo è un substrato necessario. La RNA polimerasi puo quindi iniziare la trascrizione dal primo nucleotide senza bisogno di un innesco. Questo a costo di una minor precisione di un tasso di errore più elevato (DNA polinerasi errore ogni 106 nucleotidi incorporati, la RNA polimerasi 1 ogni 104, due ordini di grandezza in più) Questo è un compromesso perche la precisione costa per la cellula, perché il processo possa essere piu o meno veloce o perché ci siano più step di controllo. Il compromesso sta nel fatto che non è necessaria un'accuratezza così scrupolosa nella trascrizione come lo è nella traduzione; questo perché l'emivita di RNA varia a seconda della loro funzione ma è comunque ridotta rispetto a quella del DNA, che deve essere mantenuto eternamente senza mutazioni. Per quanto riguarda le mocolecole di RNA, sopratutto gli RNA messaggeri, vanno incontro a diversi processi di verifica, per valutare la correttezza del trascritto, quando c'è un nucleotide sbagliato la cellula se ne accorge: nel caso in cui la molecola non superasse gli step di verifica va incontro a degradazione. Il DNA non correttamente duplicato non può venire degradato, può solo essere corretto! Il fatto che la trascrizione da parte della RNA polimerasi dia origine a un pool di molecole, viene tollerato il fatto di avere alcune mutazioni nei trascritti. Dobbiamo poi sempre ricordare che tutti i processi nelle cellule eucariotiche avvengono su DNA organizzato in cromatina, in particolare in nucleosomi; trascrivere un DNA fortemente avvolto e interagente con il nucleo istonico è molto difficile per la RNA polimerasi. Al suo passaggio, infatti, i nucleosomi devono quindi essere parzialmente smembrati, in modo tale che le interazioni tra il core istonico e il DNA sia meno forte (per rendere quindi più permissivo il passaggio della RNA polimerasi). Esistono quindi dei fattori detti fattori di allungamento (FACT), chaperoni molecolari che facilitano la trascrizione disassemblando il core istonico (che è un ottamero) in modo da lasciare alla RNA polimerasi il passaggio, e, una volta passata, il riassemblaggio della cromatina (è molto importante che la cellula mantenga il proprio assetto cromatidico). Il terzo argomento da approfondire sui mediatori verrà affrontato successivamente.LA MATURAZIONE Il trascritto primario una volta sintetizzato non è maturo, non assume immediatamente la sua forma funzionale, deve andare incontro a numerosi processi. Nell'immagine vengono riportati i processi principali a cui puo andare incontro qualsiasi trascritto, che sia procariotico o eucariotico. Alcuni di questi poi sono tipici degli eucarioti e di particolari RNA polimerasi come la 2 (ad esempio la modificazione terminale, la coda poliA, lo splicing ... ); in generale però tutti i trascritti vanno incontro a maturazione (come il taglio) La trascrizione, specialmente negli eucarioti, non produce generalmente RNA funzionali, ma molecole di precursore che potranno esercitare la loro attività solo una volta aver subito una serie di processi di maturazione

Modificazioni terminali

Modificazione chimica Taglio Cap (capping) Splicing Nuovi gruppi chimici Posizione dell' introne rimosso Queste sono modificazioni terminali a cui vanno incontro i trascritti dell'RNA polimerasi 2. Ricordiamo infatti che negli eucarioti ci sono 3 RNA polimerasi diverse, ciascuna delle quali è implicata nel processo di trascrizione di categorie ben precise di RNA. La pol. 2 è quella polimerasi che trascrive gli RNA che verranno maturati in RNA messaggeri (mRNA) e quindi verranno tradotti in proteine, ma trascrive anche la maggior parte dei geni di RNA regolatori, sia lunghi (long non coding RNA) che piccoli (short coding RNA). Questa tipologia di RNA regolatori non andrà incontro a traduzione ma verrà comunque modificata attraverso lo stesso processo maturativo.

Taglio

Sono processi di maturazione che riguardano principalmente i trascritti della RNA polimerasi 1 e RNA polimerasi 3. Infatti, la polimerasi che trascrive gli rRNA (RNA ribosomiali) crea dei lunghi trascritti primari che contengono 3 rRNA diversi, si parla dunque di trascritto policistronico in quanto contiene i geni dei 3 rRNA che poi entreranno a far parte del ribosoma (tutti tranne il 5S). Capiamo dunque come questi 3 rRNA vengono generati da un unico trascritto primario e si differenziano tramite la via maturativa del taglio. Anche i tRNA vengono maturati per la stessa via, infatti la terminazione 3' del tRNA subisce un processo di taglio durante la maturazione. Il taglio è diverso dallo splicing.

Modificazioni chimiche

Processi di maturazione che riguardano le basi e le restanti molecole del nucleotide, svolti ad opera di enzimi particolari e specifici, che aggiungono gruppi funzionali alle molecole di RNA; sono più diffuse sugli RNA sintetizzati dalla RNA polimerasi 1 e 3 (tRNA e rRNA, housekeeping). Iniziamo solo ora a conoscere quelle che sono le modificazioni chimiche e la loro funzione per quanto riguarda gli mRNA; fino a poco tempo fa si pensava che questi trascritti non subissero delle modificazioni chimiche. Ora invece siamo a conoscenza di questo processo che avviene soprattutto nelle zone di regolazione

Modificazioni terminali

Abbiamo già visto due esempi di terminazioni terminali:

• Capping: l'aggiunta del CAP al 5'
• Poliadenilazione: l'aggiunta della coda poli A al 3'.

Copyright UN askersita degli Studi Ouna NA furTutti gli studi legati alle macromolecole, sono poi sfruttati in laboratorio, per la ricerca e la sua applicazione; un esempio ecclatante lo è stato il vaccino a RNA (utilizzato anche per covid) Il vaccino a RNA verrà affrontato nelle cosiddette lezioni innovative

Splicing

Procarioti vs Eucarioti

Negli eucarioti il processo maturativo è più complesso (le specie di RNA sono molte di piu rispetto ai procarioti). Il processo è quindi semplificato nei procarioti, come si vede nel caso degli RNA messaggeri che non vanno incontro a maturazione perche durante la trascrizione viene immediatamente tradotto (ribosomi traducono partendo da 5') Negli eucarioti è diverso: la compartimentalizzazione fa si che solamente le molecole correttamente modificate e maturate possano raggiungere il punto in cui saranno funzionali, le altre verranno perse durante il cammino (quelle trascritte con errori o non completamente non riescono a raggiungere il compartimento nel quale dovranno svolgere la loro funzione) Esempio dei micro-RNA: anche loro subiscono maturazione nel nucleo che prosegue anche nel citolplasma, alla fine diventano funzionali ed esplicano la loro funzione sul loro target che è RNA messaggero (nel citoplasma)

Trascrizione, Modificazione ed Elaborazione degli rRNA

proteine ribosomiali prodotte nel citoplasma grande particella ribonucleoproteica modificazione dell'rRNA RICICLO DERNA E DI PROTEINE COINVOLTE NELLA MODIFICAZIONE DELL'TRNA 55 rRNA NUCLEOLO proteine della telomerasi RNA della telomerası subunità maggiore immatura telomerasi NUCLEO subunità maggiore subunità minore CITOPLASMA TRASPORTO E ASSEMBLAGGIO FINALE DEI RIBOSOMI subunità 40S subunità 605 Alcuni hanno funzione nel nucleo stesso come gli small nuclear Cytoplasma Zellkern RNA che intervengono nello splicing: vengono sintetizzati nel 3 SMN nucleo (DNA rappresentato in giallo, in blu gli small nuclear RNA), Sm-Protein 2 subiscono un parziale processo di snRNA maturazione e vengono esportati nel 4 Cajal Body 5 ansa di DNA cromosomico snRNP citoplasma; qui interagiscono con proteine snRNP gene per l'rRNA necessarie per il funzionamento del SM precursore Kernpore dell'rRNA 45S complesso, una ribonucleoproteina + snoRNA (snRNP) e successivamente reinportata nel nucleo dove può svolgere la sua proteine coinvolte nella funzione. DNA Osserviamo anche il processo di maturazione degli RNA ribosomilai, che vengono sintetizzati nel nucleolo e poi maturano e si assemblano con le proteine del ribosoma che vengono importate nel nucleolo; successivamente vengono esportate le due subunità dopo l'assemblaggio degli rRNA con le proteine e nel citoplasma esplicano la loro funzione Se vogliamo utilizzare le molecole per diversi apporti terapeutici (medicina a RNA) dobbiamo conoscere bene la storia di questi RNA, per sapere come utilizzarli e in quale punto del loro processo maturativo farlo.

Processo di Splicing

Processo per il quale dal trascritto primario vengono escisse regioni dette introni; le regioni rimanenti vengono definite esoni vengono unite tra di loro. Splicing letteralmente significa proprio saldatura. È un processo che avviene nel nucleo, portato avanti dalla polinerasi 2 (esistono anche splicing nel citoplasma, molto piu rari nei procarioti e in alcuni particolari trascritti degli eucarioti unicellulari)I geni eucariotici vengono quindi definiti discontinui o interrotti perché quando sintetizzati sono Stu Exon Exon Exon Exon Exon Intron Intron Untron Intron Exon Exon Intron Intron Intron RNA mRNA universitàde formati dal susseguirsi di esoni e introni Il prodotto primario della trascrizione viene definito pre-mRNA, in maniera piu generica come hnRNA, ovvero RNA nucleare eterogeneo (gli mRNA codificano per portetine ma la RNA polimerasi 2 trascrive anche altri RNA che poi non vengono tradotti e quindi non portano alla formazione di proteine) Il trascritto primario inizia sempre con l'esone 1 e finisce sempre con un altro esone n (il cui numero varia in base alla quantità di introni). Mentre gli introni per definizione sono sequenze che stanno tra due esoni. Quindi se il numero degli esoni è n il numero degli introni sarà n-1. Ora parleremo di splicing di mRNA anche se gli altri RNA sintetizzati dalla polimerasi 2 possono andare incontro a maturazione Il fatto che i geni degli eucarioti siano interrotti è stato dimostrato nel 1977 da Sharp e Roberts grazie alla R-looping. È una tecnica molto semplice: viene ibridizzata una molecola di RNA matura con il gene da cui questa molecola è stata generata. Facendo questo videro che il gene ovvero il DNA di partenza non si appaiava completamente con la molecola di RNA ma si formavano dei loop, regioni di non appaiamento. Scoprirono che queste regioni di loop erano costituite da introni. Filamento stampo del DNA mPNA Procarioti Spiazzamento del filamento codificante del DNA DNA a doppio flanc (a) Filamento stampo per l'esone 1 atempo per l'esone 2 MANA MANA DNA a doppio filamento Ansa a doppio Werdenez che contiene il mo Starpo corrispondente all'ntrone nive sitz degli Studi a. Eucarioti Questo è l'esperimento con l'ovoalbumina di pollo: rappresentazione al ME sopra che rappresenta il filamento con i loop. Il secondo esempio è con il collagene di pollo, che presenta molto piu introni rispetto all'esperimento soprastante Da qui si inizia a vedere come gli introni siano molto più lunghi rispetto agli esoni; infatti, si notano dei loop di dimensioni maggiori rispetto alle zone di appaiamento, gli esoni. Exon Exon Intron