Genetica medica: citogenetica, test genetici e sequenziamento del DNA

Genetica Medica

La genetica medica è la disciplina che si occupa di studiare le modalità di trasmissione e la patogenesi ( la causa) delle malattie che hanno in tutto o in parte come causa alcune variazioni a livello genetico.

Citogenetica

Quando parliamo di citogenetica dobbiamo pensare ai cromosomi. È una disciplina che studia i cromosomi e le loro alterazioni numeriche e strutturali. I cromosomi sono i contenitori del nostro patrimonio genetico e contengono i geni. Citogenetica branca della genetica che si occupa dello studio dei cromosomi e della loro struttura. Seconda branca è la genetica molecolare, quella branca della genetica medica che si occupa di studiare il DNA e quindi i geni.

Test Genetici e Tessuti

In laboratorio di genetica medica si maneggiano due tipi di provette: viola e verde. Questo dipende da quale diagnosi vogliamo fare:

• DIAGNOSI PRENATALE qui si maneggiano materiali come:

1. Villi coriali -> piccoli frustoli dalla parte in cui il feto è connesso alla placenta della pancia della mamma. Villocentesi -> procedura invasiva per cui intorno all'11ª-12ª settimana di gestazione alla donna gravida viene fatta (tipo biopsia), si inserisce l'ago nella pancia della mamma e si prelevano i villi coriali; In alternativa si utilizza:
2. Liquido amniotico -> dove il feto è "avvolto" nella pancia della mamma. Amniocentesi -> procedura invasiva, che si fa dalla 16ª settimana di gestazione. Nel liquido amniotico si finiscono tutte le cellule del feto;
3. Sangue fetale. - > non si usa quasi più; solo quando le gravidanze si interrompono spontaneamente oppure per interruzione di gravidanza per qualche motivo (feto che ama informazioni/ altre patologie); Allora:
4. Tessuto abortivo -> si porta il feto a fare autopsia e si preleva il tessuto/ qualche pezzettino del feto.

• DIAGNOSI POSTNATALE qui si maneggiano materiali come:

1. Sangue periferico (linfociti) oppure saliva (sempre per il DNA) -> metodo meno invasivo rispetto al prelievo;
2. Cute (fibroblasti) -> per i musicisti;
3. Midollo osseo;
4. Tessuto tumorale;
5. Linee cellulari immortalizzate -> genetica 5.0 per chi fa ricerca.

Importanza dei Cromosomi in Medicina

1. 5-10% delle persone non fertili ha alterazioni a livello dei cromosomi;
2. 50% degli aborti spontanei sono riconducibili ad anomalie cromosomiche del prodotto del concepimento;
3. 1/200 neonati ha una patologia cromosomica;
4. La maggior parte dei tumori (soprattutto ematologici) ha alterazioni cromosomiche.

Cromosomi genere umano 46, mentre prima si credeva fossero 48.

Come sono fatti i Cromosomi

Microscopio: bastoncelli/vermicelli.

Alterazioni Cromosomiche

Alterazioni cromosomiche no 464 di numero di struttura aneuploidie delezioni perdita di 1 segmento di cromatani poliploidie duplicazioni sproduzione di 1 segmenta cionosonica 1 Cromosoma traslocazioni -Ascambio di seguenti tra oramosani Aspetto all 'aceelto diploide un multiplo dell'evento generico (A) 6 es: 3n/4h inversioni brottural inversione a 180°℃ -0 @:tricomia. 91 isocromosomi * 1 cromosoma con 2 braccia Uguali Sindrome di Down " cromosomi ad anello afuzione di 2 estremità di 1 cromosoma Nel 1956 si scopre che abbiamo 46 cromosomi, grazie ad un errore fatto in laboratorio da Albert Levan e Joe Hin Tjio.La struttura dei cromosomi è sempre la stessa anche se hanno dimensioni diverse. Una parte più corta che viene chiamata braccio corto o braccio P (peti in francese che vuol dire piccolo) e un altro braccio che si chiama braccio lungo o braccio Q . Questi due bracci sono tenuti uniti da una strozzatura centrale chiamata CENTROMERO invece la fine del braccio corto e il braccio lungo si chiama TELOMERO. Abbiamo sempre coppie di cromosomi pk metà del nostro patrimonio e del padre e madre, quindi 23 coppie di cromosomi. L'ultima coppia di cromosomi determina se siamo maschi o femmine. XX DONNA = 46 XY UOMO = 46 22 coppie di cromosomi omologhi, 1 cromosomi sessuali

Anatomy of a Chromosome

Chromosome -DStruttura lineare Telomere Chromosome Spread perm x"petit" o bração corto Centromere "Q" 0 braccio lungo Telomere Greenwood Genetic Center, Genetic Counseling Aids, 2013 Se dobbiamo scrivere MASCHIO 46,XY la formula del cariotipo normale FEMMINA 46,XX Autosomi: cromosomi che non partecipano alla determinazione del sesso (22 coppie di cromosomi omologhi) Cromosomi sessuali: i cromosomi X e Y In un posto nel nostro corpo i cromosomi non sono 46 ma 23 nei GAMETI, cellule uovo e gli spermatozoi Assetto cromosomico Diploide, 46 cromosomi 2N (23per 2 )= 46 Assetto cromosomico Aploide, 23 cromosomi N=23

Concetto di Mosaico

Nello stesso individuo è possibile che un'altro e questo si chiama mosaicismo alcune cellule abbiamo un assetto cromosomico altre.

• Assetto cromosomico diploide: due copie di ogni cromosoma (2N)
• Assetto cromosomico aploide: una copia di ogni cromosoma (N)
• Aneuploidia: presenza di un cromosoma in più o in meno rispetto all'assetto cromosomico diploide 2N+1 = 47 cromosomi = trisomia ( sindrome down) 2N-1 = 45 cromosomi = monosomia

A seconda di dove si trova il centromero, il cromosoma assume un nome diverso:

• metacentrico, centromero a metà cromosoma;
• submetacentrico, centromero più spostato verso una delle estremità;
• acrocentrico, centromero all'estremità subterminale. Questi cromosomi con braccio Q e P ma solo quello lungo ha le informazioni, perché il pezzo nel braccio corto non ha informazioni importanti(per le traslocazioni Robensoniane: traslocazioni tra cromosomi acro eccentrici);
• telocentrico, centromero all'estremità terminale.

Test Genetici per Alterazioni Cromosomiche

Esistono vari test genetici per le alterazioni cromosomiche come il cariotipo, l'ibridazione in situ (Fish) e la Chromosomal microarray (Array-CGH o SNP-array).

Cariotipo

È il primo esame nella storia che si fa ancora oggi, però molto meno anche se è utile in alcuni casi. Questo tipo di esame di fa nelle provette in eparina (tappo verde).

Indicazioni Attuali del Cariotipo

• infertilità;
• poliabortività -> tanti aborti spontanei (>3), dovuti da cause materne, immunologiche, oppure soprattutto se uno della coppia è portatore sano di traslocazioni bilanciate, cioè quando avviene lo scambio di posizione tra cromosomi non omologhi che non causano perdita di materiale;
• sospetti mirati per specifiche sindromi non identificabili con altri esami;
• aborti spontanei;
• prenatale per età materna avanzata -> la donna di età maggiore ai 35 anni deve fare una villocentesi perchè aumenta la possibilità di avere trisomie;
• amenorrea primaria -> non avere mai le mestruazioni (possibile Sindreome di Turner cioè con una sola X);
• familiarità per anomalie cromosomiche note;
• tumori ematologici.

Quando faccio un cariotipo devo: - contare se ci sono 46 cromosomi; - vedere se è maschio (46,XY) o se è femmina (46,XX); - vedere se ci sono parti mancanti o in più e se ci sono traslocazioni (non evidentissime). Questo viene fatto attraverso un prelievo di un campione biologico, in provetta verde, poi messo in cultura cellulare (a crescere per 48 ore o più), strisciato nel vetrino, visto il microscopio e manualmente il citogenista li va ad ordinare, infine formato il referto.

Schema di Lavoro del Cariotipo

1. Allestimento della cultura (fitoemoagglutinina -> è una sostanza che va messa nella provetta per far crescere);
2. Blocco mitotico (per vedere il cariotipo va messa in metafase);
3. Shock ipotonico (soluzione ipotonica);
4. Prefissazione;
5. Fissazione (etanolo-acido acetico);
6. Allestimento dei vetrini con colorazione;
7. Analisi delle metafasi (microscopio ottico).

POOUTHOEK Centrifugabce Centri Wto pipette ..... . Dropping onto-a glass side Fistive Coll sediment (Heating Cover glass - Karyotype Metaphase under the microscope

Cariotipo - Terminologia

Numero cromosomi 0 Cromosomi sessuali Eventuali anomalie Dopo la virgola non si lascia lo spazi (deve essere attaccato). Esempi: - donna con sindrome di Turner -> 45,X0 / 45,X - donna che ha aborti e ha traslocazione tra il cromosoma 11 e 22 -> 46,XX,t(11;22)

Cell culture Preparation Peripheral blood Phytohemagglutinin (Mitosis stimulation) Colcemid 2h lymphocytes Cell proliferation Centri fugation 72 h Cell culture medium Cell sediment Analysis Microscopy = Photograph and karyotype = = Inbedding ----- maschio con alterazione di numero (trisomia 21)(nella coppia 21 ne ha 3) -> 47,XY,+21 La sindrome di Down (trisomia 21) può essere libera nel 97% dei casi oppure da traslocazione cromosomica nel 3% dei casi. - donna normale -> 46,XX

FISH (Ibridazione in Situ a Fluorescenza)

È anche detta ibridazione in situ a fluorescenza. È una tecnica di citogenetica che si basa sull'ibridazione (cioè legame tra DNA e sonda) in situ (sul vetrino) a fluorescenza. -> ibridazione, perchè ha un legame tra il DNA del campione e una sonda. -> in situ, perchè viene eseguita direttamente sul vetrino su cui è stato messo il campione. -> a fluorescenza, perchè la sonda è coniugata ad un fluorocromo e quindi emette fluorescenza (perchè le sonde sono marcate/unite a una sostanza che emette fluorescenza e che ci permette di vedere se c'è o no e quanto).

Prote Target JE-JF HE-HE-E k @ Fluorophore Ho una sonda (che conosco e che scelgo)che è appaiata a fluorocromi (che emettono fluorescenza) e devo passare dal doppio filamento al singolo filamento di DNA, cosi che possa ibridarsi/ legarsi al singolo filamento della sonda. Questa tecnica viene utilizzata poco, anche se costa poco. -> cromosomi con pallini verdi e rossi (sonde) -> rossa, per la regione che vado a cercare -> verde, sullo specifico cromosoma -> per sapere le delezioni

Necessità di Sonde Specifiche

Necessita di sonde specifiche a seconda della regione da indagare

Indicazioni Attuali della FISH

• Sospetto mirato di specifica delezione
• Familiarità delezione nota (per cui sia disponibile la sonda)

Provetta in eparina (tappo verde) Le sonde FISH devono essere mirate:

• per telomero -> per paziente con disabilita intellettiva viene usato spesso;
• per centromero;
• per l'intero cromosoma.

Schema di Lavoro della FISH

1. Scelta e marcatura della sonda;
2. Preparazione dei vetrini; 3. Denaturazione DNA (preparati e sonda); 4. Ibridazione; 5. Lavaggio sonda in eccesso; 6. Analisi dei preparati (microscopio fluorescenza).

Sonda Biotina (legata al dUTP) Sonda biotinata + Denaturazione della sonda Sonda DNA cromosomico TT Cromosoma con i DNA denaturato Ibrido molecolare Ibridazione S Incubazione con avidina-FITC + Vetrino portaoggetto MM V Osservazione al microscopio Avidina fluorescinata Sonda rossa: regione di delezione Sonda verde: regione di controllo per individuare il cromosoma Marcatura con dUTP-biotina A