Ematologia, emostasi e coagulazione: meccanismi e ruolo del fattore di von Willebrand

Ematologia

Emostasi e Coagulazione Università degli Studi dell'Insubria

Emostasi

• Processo con cui si controlla e si mantiene all'interno dei vasi il flusso del sangue dopo un danno vascolare
• Si compone di emostasi primaria e secondaria, indipendenti ma sinergiche

Sono coinvolti nell'emostasi: Danno al vaso sanguigno Vasi Inizio della adesività piastrinica Piastrine Aggregazione piastrinica # flusso sanguigno si ferma Formazione del tappo emostatico Fattori della coagulazione Filamenti di fibrina rinforzano il tappo Formazione di un coagulo stabile di fibrina Inibitori della coagulazione Retrazione del coaguio

Caratteristiche dell'emostasi

• Rapida
• Localizzata nel sito del danno (limite spaziale)
• Equilibrio tra processi coagulativi ed anti coagulativi (limite temporale)

Ipercoagulabilità Ipocoagulabilità Normale Trombosi Emorragie

Emostasi primaria

1. Vasocostrizione (immediata)
2. Adesione piastrinica (entro secondi)
3. Aggregazione piastrinica (entro minuti)

Emostasi secondaria

Serie di interazioni tra i fattori della coagulazione e le piastrine attivate:

1. Attivazione dei fattori della coagulazione (entro secondi)
2. Formazione della fibrina (entro minuti)

Emostasi primaria: la parete vasale

• Contrazione della muscolatura liscia
• Endoteline dall'endotelio
• Fattore tissutale (FT) dal subendotelio

Emostasi primaria: le piastrine (I)

• Frammenti del citoplasma dei megacariociti
• Discoidi, anucleate, diametro 2-3 um
• Vita media: 9-12 giorni
• Valore medio: 150-450.000/mmc
• Membrana ricca di recettori (per collagene, VWF)
• Contengono e liberano sostanze procoagulanti

Emostasi primaria: le piastrine (II)

1. Adesione tra: glicoproteina Ib e fattore von Willebrand (VWF) glicoproteina Ia e collagene sottoendoteliale
2. Cambio di forma: disco -> pseudopodi
3. Degranulazione sostanze procoagulanti
4. Aggregazione (trombossano A2): legame tra glicoproteina IIb/IIIa e fibrinogeno

Adesione piastrinica

Membrana basale lesione endotelio Piastrina GpIa GpIb Piastrina = collageno = fattore di Von Willebrand (multimero)

Il fattore di von Willebrand (VWF)

• Glicoproteina che circola nel plasma sottoforma di multimeri di diverso peso molecolare
• Sintetizzato da endotelio e da megacariociti
• Determina l'adesione delle piastrine alla matrice sotto-endoteliale e contribuisce alla loro successiva aggregazione
• Interviene anche nell'emostasi secondaria, come carrier e stabilizzatore del fattore VIII in circolo

Cambio di forma e degranulazione piastrinica

cambiamento di forma degranulazione

Aggregazione piastrinica

Fibrinogeno GpIIb-IIIa GpIIb-IIIa

Coagulazione

Si articola in 3 fasi:

1. Inizio
2. Amplificazione
3. Propagazione

Fattori della coagulazione

• Presenti nel plasma in forma inattiva (proenzimi)
• Vengono attivati a cascata (enzimi) dai fattori precedenti
• L'attivazione dipende dalla presenza di cofattori
• L'attivazione avviene sui fosfolipidi della membrana piastrinica, grazie all'azione legante di ioni calcio

VIA INTRINSECA VIA ESTRINSECA Superficie negativa SPAC * XII XIIa HMWK PK XI Ca VII VIIa Ca IX IXa X Ca VIIIa fosfolipidi X Xa Į Ca/Va/fosfolipidi VIA COMUNE II IIa (trombina) *= sistema plasmatico attivabile da contatto Fibrinogeno FIBRINA + fattore XIIIa = cross links Tromboplastina Tessutale (Fattore tessutale) Crossover XIa

Via intrinseca

Via estrinseca FXII - FXIIa + Chininogeno FXI FXIa + Calcio FIX FIXa FVIIIa FVIIa TF FX FXa

Via comune

FXa FVa I PT T FXIII FXIIIa Protrombina Trombina F Fibrinogeno Fibrina F F F

Via comune

Xa trombina V protrombina FIBRINOGENO Xa TROMBINA FIBRINA Va Ca++ Ca++ Superficie fosfolipidica Complesso Pro-trombinasico

Formazione della fibrina

TROMBINA FPA FPB B-beta FIBRINOGENO A-alfa gamma

EMOSTASI

LESIONE ENDOTELIALE 1 esposizione collagene via intrinseca liberazione fattori tessutali adesione piastrine V via estrinseca attivazione piastrine aggregazione piastrine - VASOCOSTRIZIONE TROMBO BIANCO TROMBO ROSSO (fase vasale) (fase piastrinica) deposizione di fibrina I (fase plasmatica)

Fase di rivascolarizzazione: regolazione della coagulazione

• Flusso ematico Anticoagulanti fisiologici
• Antitrombina (AT) + Glicosamminoglicani
• Cofattore Eparinico II
• Proteina C / proteina S
• Pathway di inibizione del fattore Tissutale
• Sistema fibrinolitico

Anticoagulanti endogeni

• Antitrombina III (inibisce fattori attivati II, IX, X, XI, XII)
• Eparina, attiva l'antitrombina III
• Proteina C (degrada fattori attivati V e VIII)
• Proteina S (cofattore che stabilizza la proteina C attivata)

Antitrombina

• Fa parte della famiglia delle Serpine
• Responsabile del 75% del potere anticoagulante del plasma
• Lega
• Trombina e FXa ad alta affinità
• Xlla, Xla, Ixa, Vila e plasmina a minore affinità
• La sua attività è potenziata (x1000) dall'eparina (sintetizzata dai mastociti) e dai glicosamminoglicani (GAG, es Eparansolfato) esposti sulla superficie endoteliale

Sistema Proteina C - Proteina S

APC FIXa FVIIIa PS Attivazione Inibizione FX - FXa FVa ! T PT 1 F Fibrinogeno Fibrina

La vitamina K

Interviene nella carbossilazione di un residuo glutammato dei fattori II, VII, IX e X. Si trova in vegetali a foglia verde ma anche in alimenti di origine animale.

Fibrinolisi

Dissoluzione del coagulo:

1. Attivazione della fibrinolisi (entro secondi)
2. Lisi del coagulo (entro ore)

Sistema Fibrinolitico

PAI-1 e PAI 2 Attivazione T-PA U-PA Alfa-2-antiplasmina F F F F Plasminogeno Plasmina FXIa FXIIa Precallicreina F D-dimero F F F Inibizione 1

Fibrinolisi

Attivazione intrinsica Attivazione estrinseca (fattore XIIa callicreina) (tPA, U-PA) Fibrina Plasminogeno Plasmina streptochinasi Prodotti di degradazione della fibrina D-dimero

Emostasi: test di screening

1. Conta piastrinica
2. PT
3. aPTT
4. Fibrinogeno

Conta piastrinica

• > 100.000/mmc: asintomatico, tempo di emorragia nella norma
• 50-100.000/mmc: solo lieve allungamento del tempo di emorragia
• < 50.000/mmc: porpora cutanea dopo minimi traumi, sanguinamenti mucosi dopo piccola chirurgia
• < 20.000/mmc: rischio di emorragia spontanea in sedi interne

Tempo di emorragia

Valuta l'interazione tra piastrine e parete vasale e la successiva formazione del «trombo bianco» Allungato se: - Piastrinopenie - Piastrinopatie - Carenza di fibrinogeno/VWF - Alterazioni della parete vasale Incisione 1 mm x 5 mm Pressione costante Range 2 - 10 minuti 1 40 mm 39

Valutare la coagulazione: note pratiche

Prelievo di plasma venoso Anticoagulante: citrato di sodio Centrifugazione standard Esecuzione rapida dei tests (fattori V, VIII: termolabili) Evitare prelievo traumatico Congelamento plasma -80 º C Attenzione a: poliglobulia, iperlipemia

Tempo di protrombina (PT)

• Tempo di Quick
• Valore normale: 11-13 sec o come ratio (INR) tra il plasma in esame e un controllo normale
• Efficacia via entrinseca e comune (fattori VII, I, II, V, X, NO fattore XIII!)
• Aggiunta al plasma citrato di tromboplastina tissutale e ioni calcio, poi si cronometra il tempo necessario alla formazione del coagulo

Tempo di protrombina (PT) applicazioni cliniche

Applicazioni cliniche: PT corto: no significato patologico PT lungo:

1. Epatopatia
2. Deficit di vitamina K
3. Sindrome nefrosica/malassorbimento
4. Deficit/inibitori del fattore VII
5. Monitoraggio farmaci dicumarolici (INR)

International Normalized Ratio (INR)

ISI Patient's PT in Seconds INR = Mean Normal PT in Seconds INR = International Normalized Ratio ISI = International Sensitivity Index

Tempo di tromboplastina parziale attivato (aPTT)

• Valore normale 28-40 sec o come ratio tra il tempo del plasma in oggetto e quello di un controllo normale
• Via intrinseca e comune (fattori I, II, V, X, VIII, IX,XI, XII, NO XIII!)
• Aggiunta al plasma citrato di agenti attivanti (caolino), una emulsione di fosfolipidi (sostituti delle piastrine) e ioni calcio, poi si cronometra il tempo necessario alla formazione del coagulo

Tempo di tromboplastina parziale attivato (aPTT) applicazioni cliniche

Applicazioni cliniche: aPTT corto: no significato patologico aPTT lungo:

1. deficit di fattori della coagulazione (VIII, IX, XI)
2. inibitori della coagulazione (anti fattore VIII, anticoagulante lupico)
3. terapia con eparina

Prove di correzione aPTT

Carenza fattori? Anticoagulante lupico (LAC)? Inibitore anti-fattore?

Prove di correzione aPTT

1. aPTT paziente
2. Miscela 1 (pool + tampone) Miscela 2 (pool + paziente)
3. aPTT delle 2 miscele

TEST DELLA MISCELA Plasma in esame Plasma normale miscela 1:1 (incubazione a 37°℃) aPTT

Prove di correzione: aPTT delle 2 miscele

1. Se corregge subito: carenza fattori
2. Se corregge con aggiunta di fosfolipidi: LAC
3. Se corregge dopo 2 ore: inibitore anti-fattore
4. Correzione parziale: - Verificare la presenza di eparina - Ripetere dopo prolungata incubazione a 37° - Eseguire comunque la ricerca del LAC

Allungamento di PT e aPTT

PT XII APTT XI VII IX VIII XVIII Carenza/inibitori di fattore I, II, V, X Coagulazione intravascolare dissemminata Epatopatia grave Diluizione post-trasfusionale

Fibrinolisi: test di laboratorio

• Fibrinogeno: valore normale 150-350 mg/dl
• Prodotti di degradazione del fibrinogeno e della fibrina (FDP < 10ug/dl, D-dimero < 500 ng/ml)
• Antitrombina III

Alterazioni del fibrinogeno

• Deficit quantitativi o qualitativi
• Aumentato in caso di: infiammazioni, neoplasie, gravidanza

Coagulazione: test di secondo livello

Dosaggio dei fattori della coagulazione

• Livello emostatico: 20 UI/dl 5 U/dl per fattore XIII
• Emivita: 24 h (IX), 12 h (VIII), 6 h (VII), ...
• Resa: 1 U/dl (IX), 2 U/dl (VIII), ...

Coagulazione: test di secondo livello (II)

Tempo di trombina

• Tempo alla formazione del coagulo quando il plasma viene ricalcificato con concentrazioni normali di trombina
• Esplora la fase finale della coagulazione
• Allungato se: deficit fibrinogeno, anticoagulanti, prodotti di degradazione del fibrinogeno

Il tromboelastografo (TEG)

Analizza l'intera coagulazione e l'interazione tra piastrine, fattori della coagulazione e fibrinogeno Coagulation Fibrinolysis Clotting time (R) Clot kinetics (K,«) Clot strength (MA) Lysis time

Il tromboelastografo (TEG) sample tracings

Sample TEG® Tracings 1 2 H T 3 T 4 5 1 1) Tracciato normale 2) Deficit fattori della coagulazione congenito o acquisito 3) Deficit estremo fattori che inibisce anche l'adesività piastrinica 4) Severa disfunzione PLT con leggero deficit fattori 5) Iperfibrinolisi secondaria (es CID)