Appunti sull'autofagia: meccanismi cellulari e patologie

Introduzione all'Autofagia

Patologia I, lezione 8, 17/03/2023
Prof. Pinton
AUTOFAGIA
Il termine autofagia significa proprio mangiarsi, mangiare sé stesso è un meccanismo vitale per la cellula ed
è un processo catabolico in cui porzione di citoplasma e organelli vengono esposti all'azione degradativa dei
lisosomi. Tutto ciò che viene sequestrato viene degradato. Allo stesso tempo è un meccanismo di ricambio di
organelli, di strutture cellulari, ma anche un meccanismo di morte cellulare.

Tipi di Morte Cellulare

Dentro le nostre cellule, tessuti e organi, esistono centinaia di tipi di morte cellulare, tutti diversi tra di loro.
Possono essere dal punto di vista tradizionale, punto di vista di attivazione, come enzimi, caspasi, oppure da
un punto di vista morfologico come ad esempio nell'apoptosi, c'è una circolazione della cellula fino a che non
viene degradata; invece nell'autofagia ci sono delle vescicole che vanno a uccidere ciò che fa uccidere le
cellule. Tutti questi tipi di morte cellulare sono importanti per le cellule e importanti per il mondo della ricerca,
e come potete vedere ogni tanto viene fatta una nomenclatura nuova appunto perché vengono continuamente
scoperti dei tipi di morte cellulare nuovi che hanno caratteristiche funzionali, biochimiche e morfologico-
funzionali all'interno della cellula.

I principali tipi di morte cellulare sono questi tre. Voi sicuramente avete sentito parlare di apoptosi e necrosi.
La necrosi è la morte violenta della cellula, che vive in condizioni di ipossia, ipotermia, ischemia in seguito a
infezioni o traumi e che va a creare una forte reazione infiammatoria locale. Allo stesso tempo, però, la necrosi
può essere anche un meccanismo di morte cellulare programmata, cioè la cellula che decide di andare incontro
a necrosi per morire.

Necroptosi e Apoptosi

In questo caso si parla di necroptosi, che è una via intermedia fra l'apoptosi e la necrosi. Significa che alcune
caratteristiche della necrosi sono comuni all'apoptosi. Quest'ultima è la classica morte cellulare che si attiva
durante lo sviluppo, durante il differenziamento e durante diverse patologie. Per quanto riguarda il cancro, le
cellule non vanno più in apoptosi, quindi proliferano in maniera incontrollata, e nelle malattie
neurodegenerative l'apoptosi va a uccidere neuroni e quindi va a creare neurodegenerazione. Poi c'è questo
fantastico nuovo metodo per morire, l'autofagia, che è proprio la cellula che dice "voglio morire" e per morire
si auto-digerisce. E principalmente dal punto di vista della morte è un sacrificio che una cellula fa per le tutte
le altre. Nel momento in cui la cellula va incontro ad autofagia viene digerita, ma viene riciclata. Quindi ad
esempio proteine, zuccheri o altro che vengono degradati, vengono riciclati in amminoacidi per far partire ad
esempio le proteine e nuovi zuccheri oppure il nuovo DNA. È un processo fisiologico, quindi nella nostra
cellula ci sono livelli basali di autofagia, ma eccessivi livelli di autofagia o livelli troppo bassi possono
scatenare delle patologie. L'autofagia, anche se sono circa vent'anni che se ne sente parlare tanto, è stata
1scoperta nel lontano 1955 da questo premio Nobel, Christian De Duve, che in verità ha vinto il premio Nobel
per le sue scoperte sui lisosomi. Quindi ha visto che c'erano delle strutture strane vicino ai lisosomi invece
delle vescicole, e che ha chiamato autofagia.

Storia dell'Autofagia e Premi Nobel

Come potete vedere dallo
Timeline | A history of autophagy
schema
temporale,
Christian de Duve
The Meijer laboratory finda a
I Beaslistos and K & ectshin waageut
Gordonand Seglen
Premio nobel per la
angiesomcmna
C.de Duveand
G. Nenimoreand C. Schwererfine
andandocytesk".
AKlageresver
indem autophagy!
cervegereprint
medicina (1974) per i
suoi studi sui lisosomi.
1955
1263
1973
1903
Fu il primo a coniare il
termine autofagia
de Duve deseries the
IL Belen&rardE Webel
P. Sellen and F Cordon carry
E Oleumi and colleagues
Mizushima et al idensly
(1955)
The Olivari labor etery reperti
the fra scode ta idintilyyeast
aufcolagymutas". Several
grouch und Sonstmetho-de N
he Onumi group dones yeast
others discover
the bancamak
APGI GET 401 Thirty more
de Duve und ILDubir
Showthat glucaque
l'autofagia negli anni ha
sempre più preso piede, si è
A.Meter and colleagues
coirs the name'autophagy.
seguestrationotas
Joc wrvont the simsulatory
cunt the fost biochemical
analyuk of astichecw and
roleofrapammon".
Hond6, 1-methyladenine as
connorvation of Atal 2-
anironter"
Angs cosjegwion",
iniziato un pochino
ATGt, mitophagy related gene-1:RC1 2, anti-apoptotie peritoin 8-cvilllymphera-2; RFCNI, heelin-1; LCR. mammalian Atg&hanelogun;PRE phosphatidylinositol 1-kinase
a
The Mizehera laboratory groveles evidence for a
- ---
studiare a capirne
le
B. Leriw'slaboratory
terrifies BECSMAICA na
protective mie-aff
Yoshinori Ohsumi
Premio nobel per la
medicina (2016)
1999
2000
2002
2001
zace
per i suoi studi
T Whimeri andN Mia tina
The levite and Heintr laboratories
sull'autofagia
caratteristiche biochimiche,
i fattori di coinvolgimento
arcchaty in higher eukaryotes"
The Bergines andLevine groupe
correut autophag withlongevity/"
delle cellule della patologia
e appunto la dimostrazione di quanto importante è l'autofagia. Nel 2016 questo ricercatore giapponese ha vinto
il premio Nobel per la medicina appunto per i suoi studi su autofagia. È stato il primo ricercatore che ha proprio
scoperto che c'erano dei geni specifici all'interno della cellula che sono responsabili dell'autofagia.

Geni ATG e Funzione

Grazie ai suoi studi si sono potuti
Table 1 | Autophagy genes in mammals*
identificare questi geni essenziali
Gene
Protein function
ATG1, ULK1+
Atg1 is a serine/threonine protein kinase; it may be involved in regulation and vesicle formation
per questo meccanismo di morte,
ATG3
Atg3 functions as an ubiquitin-conjugating-like enzyme that covalently attaches Atg/LC3 to
phosphatidylethanolamine
che si chiamano geni ATG
ATG4
Atg4 is a cysteine protease that cleaves the C-terminus of Atg8/LC3 to expose a glycine residue
for subsequent conjugation
(autophagy related genes) e
ATG5
Atg5 is covalently attached to Atg12, and binds Atg16 as part of a tetrameric complex of
unknown function
ATG6, Beclin 1+
Atg6 is a component of the class III phosphotidylinositol-3-kinase complex that is required for
autophagy
sono fondamentali sia per lo
ATG7
Atg7 is a homologue of the ubiquitin-activating enzyme; it activates both Atg8/LC3 and Atg12
before conjugation
sviluppo che per la crescita e la
ATG8, MAP1LC3#
Atg8/LC3 has structural similarity to ubiquitin; it is conjugated to phosphatidylethanolamine,
and is part of the autophagosome, but its function is not known
maturazione dell'embrione. Sono
ATG9
Atg9 is a transmembrane protein that may be involved in delivering membrane to the forming
autophagosome
geni che sono presenti nel lievito,
ATG10
Atg10 functions as an ubiquitin-conjugating-like enzyme that covalently attaches Atg12 to Atg5
mammiferi, insetti, vermi o piante e
ATG12
Atg12 has some structural similarity to ubiquitin; it is conjugated to an internal lysine of Atg5
through its C-terminal glycine
ATG16
Atg16 binds Atg5 and homo-oligomerizes to form a tetrameric complex
come vedete sono tutti chiamati
ATG1, ATG2, ATG3 e così via. Al giorno d'oggi ce ne sono più di una cinquantina e, mentre nel lievito
vengono chiamati tutti ATG, nei mammiferi hanno nomi specifici. Tornando all'autofagia, di per sé, significa
mangiare se stessa ed è un fenomeno associato a delle vescicole. All'interno della cellula c'è qualcosa che va
degradato e le vescicole si organizzano intorno a questa cosa da degradare, la rinchiudono e queste vengono
veicolate verso i lisosomi per fondersi e per degradare quello che viene sequestrato.

Attivazione dell'Autofagia

Nei mammiferi e anche nel lievito, avviene in condizioni basali e può essere attivato per privazione di un
nutriente. Infatti l'autofagia è attivata principalmente dalla dieta, dalle calorie. Abbiamo anche trattamenti
farmacologici che possono attivarlo oppure inibirlo e alterazioni della funzionalità del macchinario autofagico
2determina l'attivazione di patologie, in particolar modo tumori e neurodegenerazione o patologie
cardiovascolari. Comunque tutte quelle patologie che sono coinvolte e che hanno bisogno di energia.

Processo di Autofagia

Andando un pochino più in dettaglio,
quello che succede durante l'autofagia
è che ci sono delle vescicole che sono
Pre-autophagosomal
Autophagosome
Lysosome
structures (PAS)
a doppia membrana e delle membrane
che si organizzano per formare una
Autofagosomi fondono prima con gli endosomi a formare
un organello "ibrido" denominato AMFISOMA
Fonde poi con i lisosomi a formare il cosidetto
Autolysosome
AUTOFAGOLISOSOMA
vescicola che andrà a inglobare.
Quello che va degradato durante
questo processo viene chiamato "fago foro" e nel momento in cui la vescicola si completa si va a formare un
altro fagosoma che contiene tutto ciò che va degradato, che possono essere porzioni del citoplasma, organelli,
virus, materiale estraneo. Successivamente, l'autofagosoma si muove verso il distretto in cui ci sono i lisosomi
e si fonde. Fondendosi si va a creare l'auto-lisosoma, definito anche autofago-lisosoma. Finché c'è solamente
l'auto-fagosoma, il processo è reversibile, cioè quello che viene sequestrato può essere liberato. Nel momento
in cui si forma invece l'autofago-lisosoma, cioè l'autofagosoma insieme al lisosoma, il processo è irreversibile.
Questo perché nel momento in cui avviene la fusione, gli enzimi idrolitici del lisosoma vengono
immediatamente riversati all'interno e si ha degradazione.

Misurazione dell'Autofagia

Grazie alla ricerca riusciamo anche a vedere l'autofagia, lo stiamo proprio misurando nelle cellule. Possiamo
farlo in questo caso tramite microscopia elettronica. Prendiamo un preparato di cellule o di tessuto che viene
tagliato e visto per microscopio elettronico e gli autofagosomi appaiono come questi corpi elettrondensi in cui
si ha il materiale all'interno che è stato sequestrato. Si può vedere tramite il Western bloth. Quindi ci sono dei
marker specifici di autofagia e, in base a quanto sono espressi, a quanto sono abbondanti, possiamo dire se c'è
o non c'è autofagia. In questo caso vedete il marker LC3 che aumenta e quindi aumenta l'autofagia, oppure è
possibile vedere gli autofagosomi dal vivo mediante microscopia a fluorescenza.

Ruoli dell'Autofagia

Sono state ingegnerizzate delle proteine e sono state fuse insieme a delle reporter fluorescenti. In questo caso,
il reporter fluorescente è LC3GFP, e nel momento in cui c'è autofagia si formano gli autofagosomi e quindi li
vedete proprio in questa distribuzione all'interno della cellula. L'autofagia, come dicevo, ha diversi ruoli, è
coinvolta nella morte cellulare, però non è un semplice processo di degraazione. L'autofagia ha anche una
funzionalità di housekeeping, cioè permette di mantenere l'omeostasi della cellula, controllando l'equilibrio,
il volume della cellula, il numero di organelli e i nutrienti all'interno. In caso di mancanza di nutrienti, quindi,
stabilisce una restrizione calorica, l'autofagia va a degradare proteine per avere dei nuovi amminoacidi da cui
costruire delle proteine. Allo stesso tempo riesce a cambiare perché coinvolta nel turnover di componenti
cellulari in quanto, se ad esempio ci sono troppi mitocondri all'interno della cellula, questi vengono degradati
per ristabilire il numero corretto dei mitocondri. L'autofagia è coinvolta nello sviluppo cellulare ed è stato visto
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