Microbiologia enologica: tassonomia e preparazione dei lieviti per l'inoculo

Microbiologia Enologica: Tassonomia e Preparazione dei Lieviti

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Microbiologia enologica Microbiologia Università degli Studi di Milano 65 pag.

Document shared on www.docsity.comLezione 0 - 2/11/21

Inquadramento Tassonomico dei Lieviti

La tassonomia, o sistematica microbica, è la scienza che studia e mette in evidenza le relazioni naturali fra i microrganismi attraverso un insieme di teorie e di tecniche.

Definizioni Chiave

• Identificazione: Processo di riconoscimento di microrganismi già classificati o di nuova identificazione.
• Classificazione: Raggruppamento dei microrganismi sulla base delle loro somiglianze in diversi livelli chiamati taxon.
• Nomenclatura: Assegnazione dei nomi in base a regole internazionali.

· Nomenclatura binomiale: genere (prima parte) ; specie (seconda parte).

• Specie: insieme di ceppi con in comune un elevato numero di caratteri e che differiscono in modo apprezzabile da altri gruppi di ceppi.
• Ceppo: insieme di discendenti di una singola cellula isolata in coltura pura (colonia) e conservato mediante una serie di subcolture derivanti dalla medesima colonia.

· Type strain -> ceppo tipo scelto, solitamente come primo rappresentante, a riferimento delle caratteristiche della specie; · Reference strain -> ceppo di riferimento con caratteristiche paragonabili al ceppo tipo e anch'esso depositato in banche dati internazionali.

Criteri Tassonomici

1. Aristotele, Linneo -> Organismi raggruppati in base alle proprietà naturali; schema a due regni: animale (includeva protozoi) e vegetale (comprendeva protozoi, funghi, batteri)
2. Whittaker (schema a cinque regni) -> Organismi raggruppati in base a tre criteri: tipo di cellula (procariote o eucariote); tipo di organizzazione (unicellulare o pluricellulare); modo di alimentarsi (fotosintesi, assorbimento ed ingestione).
3. Tassonomia filogenetica (Woese) -> Organismi raggruppati in base ad affinità evolutive, in pratica in base alle loro relazioni naturali. Studia le relazioni tra i microrganismi in base alla similarità di sequenze geniche denominate "marcatori filogenetici universali"

Woese fu il primo a dimostrare l'utilità delle piccole subunità ribosomiali (16S rRNA) "Perché scegliere rRNA come marcatore tassonomico universale?" rRNA è presente in tutti gli organismi; la sua struttura è stata conservata sufficientemente durante l'evoluzione; Il 16S rDNA (nei procarioti) ed il 18S rDNA (negli eucarioti) hanno dimensioni adatte all'analisi delle singole mutazioni nella sequenza nucleotidica.

· Albero filogenetico -> Mostra le relazione naturali tra varie specie o altre entità che si pensa posseggano un progenitore comune. L'allineamento delle sequenze dei marcatori molecolari permette di evidenziare le differenze di basi nucleotidiche tra gli organismi. I dati vengono elaborati da algoritmi atti alla costruzione degli alberi cha si basano su modelli evolutivi. In un albero filogenetico si riconoscono i nodi terminali (i microrganismi) ed i nodi interni (gli antenati).

N.T. 2 N.I. 1 3 1

Document shared on www.docsity.comIn generale, da ogni nodo interno si dipartono tre rami, uno ascendente che porta al nodo progenitore (il più recente antenato comune dei discendenti) e due discendenti. Ogni nodo viene chiamato "unità tassonomica".

1. Tassonomia polifasica -> Oggi l'identificazione e la caratterizzazione microbica seguono un approccio multidisciplinare (tassonomia polifasica) che utilizza sia caratteri fenotipici che caratteri genotipici.

Lieviti: Classificazione e Riproduzione

Sono microrganismi unicellulari, la maggior parte di questi sono ascomiceti e basidiomiceti (appartenenti al regno Eumyceti). Questi tipi di lieviti si riproducono per gemmazione o riproduzione sessuale. I basidiomiceti sono spesso presenti sull'uva e vengono considerati "lieviti innocui".

Saccharomyces Complex

L'analisi filogenetica effettuata sull'intera classe Hemiascomycetes (75 specie), tramite l'allineamento grafico delle sequenze nucleotidiche di ben 8 geni, ha permesso di distinguere 14 raggruppamenti.

Lezione 1 - 5/11/21

Lieviti di Interesse Enologico

I lieviti appartenenti agli Ascomiceti, Basidiomiceti e funghi imperfetti (Deuteromiceti) sono divisi in 81 generi, a cui appartengono 590 specie Non tutte si possono trovare nel mosto o nel vino, solo 15 sono di interesse enologico (ovvero fanno fermentazione alcolica e possono essere coinvolti nelle alterazioni del vino) e sono divisi in 2 gruppi principali:

1. Sporigeni -> producono spore, fanno parte di questi i cerevisiae e torulaspora
2. Asporigeni -> hanno una crescita vegetativa, fanno parte di questi i Brettanomyces

• I lieviti si trovano nel suolo, sulla superficie dei vegetali e nel tratto digestivo degli animali
• Sono distribuiti irregolarmente sulla superficie della vite
• Colonizzano la buccia dell'uva durante la maturazione
• Le specie presenti sulle uve possono essere suddivise in diversi gruppi in base al loro significato tecnologico sull'uva e nella produzione di vino.

Classificazione dei Lieviti in Base al Metabolismo

I lieviti vengono suddivisi in base al loro metabolismo:

• Lieviti ossidativi, debolmente fermentanti, questi possono poi suddividersi in:

· I lieviti apiculati, caratterizzati dalla loro forma microscopica, alle due estremità opposte della cellula si formano due protuberanze che al microscopio fa assumere una forma di limone, questo è dovuto al fatto che la gemmazione, quindi la formazione delle nuove cellule dalle cellule madri, si origina in modo apicale, quindi si producono gemme solo alle due estremità della cellula; alcuni ceppi possono produrre composti con sapori e aromi sgradevoli nei mosti e nei vini. Sono lieviti che fanno una fermentazione difficile con poca produzione di etanolo, sono presenti nelle prime fasi di fermentazione per poi scomparire a causa della bassa tolleranza all'etanolo. Tra questi lieviti troviamo la Hanseniaspora, la Kloeckera · I lieviti filmogeni (lieviti deboli), devono la loro denominazione alla capacità di formare pellicole sulla superficie dei vini sfusi, essendo contaminanti comuni di uva, succhi di frutta e vini, con la capacità di produrre aromi sgradevoli. Sono lieviti aerobi, quindi riescono a svilupparsi se c'è ancora una presenza di ossigeno nel mosto, per questo motivo sono lieviti associati solo alle prime fasi fermentative, quando dopo la pressatura si ottiene un mosto ancora ricco di ossigeno, oppure sono associati alla fine della fermentazione quando ci sono i travasi in quanto durante il travaso c'è una dissoluzione dell'ossigeno

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Document shared on www.docsity.comall'interno della soluzione idroalcolica e alcuni lieviti, se presenti, riescono a svilupparsi sfruttando questa presenza di ossigeno. Alcuni si sviluppano nella parte alta del vino producendo dei film, sono anche detti per questo lieviti filmogeni: posizionandosi nell'interfaccia tra ossigeno e vino possono ossidare etanolo utilizzandolo come fonte di carbonio e trasformandolo in acido acetico, si ha quindi una dequalificazione del prodotto.

• Lieviti fortemente fermentativi, presenti in fermentazione oppure alla fine, sono lieviti fortemente resistenti all'etanolo e comprendono:

· Saccharomyces cerevisae, comprende ceppi con caratteristiche metaboliche diverse. Completa il processo fermentativo, questo permette la creazione di vini secchi (arriva intorno a 2/3 g/L di zucchero) · Zygosaccaromyces bailii e Z. rouxi: lieviti resistenti all'acido sorbico e responsabili delle rifermentazioni, più deboli di cerevisiae · Saccaromycodes ludwigii: lieviti resistenti all'anidride solforosa; · Schizosaccaromyces pombe: lieviti della degradazione malica; · Dekkera/Brettanomyces: produttore di off-flavours, ovvero di aromi sgradevoli

L'equilibrio tra questi gruppi, dopo l'invaiatura, è particolarmente dipendente dalla disponibilità di nutrienti sulla superficie della bacca. Le popolazioni di lievito sull'uva sono approssimativamente comprese tra 102 e 104 cellule/g di uva nel caso di uve sane, su uve malate si ha un quantitativo maggiore.

Fattori che Influenzano la Biodiversità dei Lieviti

1. Condizioni climatiche (temperatura, esposizione ai raggi UV, pioggia, sole e vento)
2. Trattamenti in vigna (l'uso di trattamenti fitosanitari, soprattutto quelli contro i funghi (peronospora, oidio e muffa grigia).
3. Vettori microbici (l'associazione tra lieviti e invertebrati è ben noto in studi ecologici generali)

Saccharomyces Cerevisiae: Caratteristiche e Presenza

Saccharomyces cerevisiae (viene stabilito che sia un lievito da cantina)

• estrema rarità di S. cerevisiae sulle uve
• presenza di S. cerevisiae naturale o di ibridi (S. uvarum) in cantina
• La frequenza di isolamento di S. cerevisiae: tra circa 0.05 a 0.1% in acini sani e il 25% nelle bacche danneggiate (105 - 10° cell/acino)
• Lo si trova in tutti gli attrezzi usati in cantina, esso è in grado di entrare in uno stato di "quiescenza" aspettando che ci sia nuova sostanza organica per esempio in pompe e tubazioni. Negli anni si è anche notato che questo lievito fa più facilmente fermentazione in vasche già utilizzate rispetto a vasche nuove.
• Sebbene questo lievito sia portatore di un numero ridotto di cellule, questo prende il sopravvento nella sua evoluzione, ha dei geni che gli permettono una fermentazione molto efficiente, nel momento in cui un Saccharomyces trova uno zucchero, rispetto alle specie che contaminano l'uva, domina.

La Cellula di Lievito: Struttura e Componenti

• I lieviti sono i più semplici degli eucarioti;
• La cellula di lievito contiene un citoplasma con vari organelli e un nucleo circondato da una membrana che racchiude i cromosomi;
• Come le cellule vegetali, la cellula di lievito ha due involucri cellulari: la parete cellulare e la membrana;

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Document shared on www.docsity.com· Lo spazio periplasmico è lo spazio tra la parete cellulare e la membrana; · Il citoplasma e la membrana costituiscono il protoplasma. Il termine protoplasti o sferoplasti designa una cellula la cui parete è stata rimossa artificialmente;

Parete Cellulare del Lievito

E' un organello dinamico e multifunzionale. La sua composizione e funzione evolvono durante la vita della cellula, in risposta a fattori ambientali

• Rappresenta circa il 15-25% del peso secco della cellula;
• Essa consiste essenzialmente di polisaccaridi;
• Si tratta di un involucro rigido, ma dotato di una certa elasticità.

Ruolo della Parete Cellulare

• Protezione della cellula;
• Dà alla cellula la sua particolare forma;
• Interazioni cellulari (unione sessuale, flocculazione, fattore killer).

E' la sede di enzimi (idrolasi),i cui substrati sono o sostanze nutritive dell'ambiente o le stesse macromolecole della parete (+costantemente rimodellano la parete). Partendo dall'interno si ha la membrana citoplasmatica, poi uno spazio periplasmatico che è molto importante perchè accumula molti enzimi che sono glicosilati (hanno una parte glicosidica legata ad essi), che sono proteine che vengono poi trasportate al di fuori della cellula e in particolare nello spazio periplasmatico. C'è poi la parete costituita da:

• una piccola percentuale di chitina, 1-2% -> È una molecola che contiene N- acetilglucosammina, è un omopolimero di N-acetilglucosammina, queste molecole sono legate tra loro tramite ß-1,4 glucosidico e formano questo polimero che è presente nel regno fungi (Saccharomyces cerevisiae), ma anche nel regno animale. Può essere considerata come una cellulosa nella quale al gruppo di idrossile su ogni monomero sia stato sostituito un gruppo di acetilammina, la si trova per la maggior parte (ma non esclusivamente) nelle zone dove si sono create le cicatrici delle gemme. La chitina è collegata alla parete cellulare o situata nello spazio periplasmico.
• Grande percentuale di polisaccaridi, 80-90%, (B glucani), sono degli zuccheri che si alternano con legami beta. Al di sopra di questa struttura di ß glucani c'è un rivestimento molto abbondante in mannoproteine.

I glucani rappresentano circa il 60% del peso secco della parete cellulare di S. cerevisiae. Sono polisaccaridi costituiti da molecole di glucosio unite mediante legami ß-glicosidici. Possono essere chimicamente frazionati in tre categorie:

1. Il ß-1,3 glucano fibroso: Grado di polimerizzazione di 1500 unità di glucosio. Ha poche ramificazioni in 3-1,6. Assicura la forma e la rigidità alla parete cellulare. E' sempre collegato alla chitina;
2. Il -1,3 glucano amorfo: Grado di polimerizzazione di 1500 unità di glucosio. Ha poche ramificazioni. Dà alla parete cellulare elasticità e agisce come un'ancora per le mannoproteine;
3. Il ß-1,6 glucano: Grado di polimerizzazione di 450 unità di glucosio. Altamente ramificato da legami 3-1,3 glicosidici. Collega le diverse componenti della parete cellulare insieme. E' anche un sito recettore per il fattore killer.

• Mannoproteine è la parte superficiale della parete, costituiscono il 20-25% del peso secco del lievito e sono proteine a cui sono legate molecole di mannosio (per la maggior parte). Esse

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