Microbiologia: Micobatteri e Tubercolosi, caratteristiche e patogenesi

I Micobatteri

Milano, Minelli, Poli Microbiologia (Marangoni) Lezione 013 22-03-2022 Ora ci occupiamo della parte sistematica della microbiologia, in particolare iniziamo con i batteri: I MICOBATTERI I micobatteri sono una categoria particolare di batteri per cui non si utilizza la colorazione di Gram ma quella di Ziehl-Neelsen. Sono dei bacilli, ossia dei batteri allungati, sempre aerobi, immobili e non formano spore.

Hanno una parete ricca di lipidi che rende impossibile la decolorazione con acido cloridrico durante il primo passaggio della colorazione di Ziehl-Neelsen.

Esistono tante specie di micobatteri, la maggior parte sono ambientali e quindi non patogeni.

I più importanti per quanto riguarda la patologia umana invece sono:

• quelli riguardanti il complesso della tubercolosi
• il Mycobacterium leprae che è il responsabile della lebbra (conosciuto quindi da millenni).

Per via della loro parete robusta e caratteristica sono in grado di resistere all'essiccamento e anche all' utilizzo dei normali disinfettanti.

Sono per lo più dei batteri a lentissima crescita, altri invece, hanno tempi di divisione normali. La crescita lenta è dovuta alla parete così spessa che limita quindi gli scambi con l'esterno.

Per la coltura in laboratorio è previsto un uso di terreni particolarmente ricchi di lipidi (come il tuorlo d'uovo) di cui si servono per incorporarli nella loro parete.

Habitat e Diffusione dei Micobatteri

Habitat e diffusione: i micobatteri si ritrovano nel suolo, nelle acque, negli animali; sono resistenti all'essiccamento e ai disinfettanti chimici, grazie all'alto contenuto di lipidi della parete cellulare.

Terreni di Coltura per Micobatteri

Terreni di coltura: si usano dei terreni molto ricchi a base di tuorlo d'uovo (Lowenstein-Jensen) e contenenti sostanze che ostacolano lo sviluppo di contaminanti, dal momento che il ritmo di moltiplicazione è estremamente lento rispetto alla maggior parte degli altri batteri.

Mycolic acids D-arabinose and Arobinogalocton mycolate loyer D-golactose N-acetylglucosamine and Peptidoglycan D-glutamic acid, love m-dominopimelic acid, I- and D-alanine Polypeptides [e.g., PPD] Mycolic acids [free lipids, glycolipic, peptidoglycolipic) Cytoplasm - Cytoplasmic membranes Mosby, Inc. ismi and derived items copyright 0 2002 by Mody, Inc.

Involucri Esterni dei Micobatteri

Involucri esterni Glicolipidi fenol Acidi micolici Lipo arabino-mannand Arabino-galattani Peptidoglicano Fosfoinositido- mannani Proteine Membrana cellulare

Nella parete dei micobatteri troviamo:

• Cere: Acidi micolici (acidi grassi complessati con dei glicolipidi fenolici)
• Arabino-galattani che legano gli acidi micolici al peptideglicano, il quale ha uno spessore simile a quello dei batteri Gram negativi

Questi involucri esterni (tra cui troviamo anche il lipo-arabino- mannano) determinano la resistenza all' essiccamento, all'utilizzo di disinfettanti, all'azione di vari acidi, tra cui acido cloridrico, e anche alla maggior parte degli antibiotici.

Micobatteri del Complesso della Tubercolosi

Micobatteri del complesso della tubercolosi Si parla di "complesso" perchè già da anni come agente eziologico della tubercolosi viene riconosciuto non solo il Mycobacterium tubercolosis, ma anche altri due micobatteri:

• Mycobacterium africanum: causa la tubercolosi soprattutto nel continente africano;
• Mycobacterium bovis: è l'agente eziologico della tubercolosi bovina. In questo caso la via di trasmissione all'uomo non è quella aerogena, ma quella alimentare, soprattutto da latte non pastorizzato di bovini infetti. Non è più un problema in paesi europei o comunque con standard igienico elevato. Rimane diffuso in altre realtà mondiali.

M. tuberculosis M africanum M bovis acetylmuroric acid

I micobatteri causano per lo più infezioni intracellulari (es. infettano i macrofagi delle vie respiratorie), portando alla formazione di lesioni granulomatose : lento sviluppo, responsabili della distruzione tissutale 1/11Milano, Minelli, Poli Microbiologia (Marangoni) Lezione 013 22-03-2022

Mycobacterium Tuberculosis

Mycobacterium tubercolosis Per quanto riguarda il Mycobacterium africanum, le caratteristiche sono simili al Tubercolosis che verrà preso in esame nella spiegazione.

L'agente eziologico della tubercolosi causa un importante problema di salute pubblica. Ogni anno nel mondo ci sono infatti circa 9 milioni di nuovi casi di tubercolosi attiva. In realtà questo numero rappresenta solo una piccola parte di persone che sono esposte a questi batteri (comprendendo anche l'africanum).

E' una malattia che ancora oggi ha un'elevata mortalità a causa per esempio di una maggior antibiotico resistenza acquisita negli ultimi anni. C'è un'alta associazione della tubercolosi attiva con persone particolarmente fragili come pazienti HIV positivi già nello stadio di AIDS conclamato.

Epidemiologia della Tubercolosi

Mycobacterium tuberculosis È l'agente eziologico della tubercolosi (TBC) La diffusione è più elevata nei paesi con un PIL ed uno standard igienico meno elevato, ma comunque è una patologia riemergente Epidemiologia della tubercolosi (TB) anche nei paesi europei.

estimated TB incidence rates, 2010 L' Italia rientra nei paesi a bassa incidenza se prendiamo in considerazione tutta la popolazione. Ma ci sono dei picchi di incidenza importanti in alcune categorie a rischio con pazienti fragili come HIV positivi e immigrati provenienti dall'Africa Subsahariana. In questo ultimo caso in particolare possono essere colpite anche persone giovani senza altri fattori di rischio perché provengono da paesi dove la presenza del micobatterio è molto alta.

• Nel Mondo 8,8 milioni di nuovi casi ognianno (alta associazione .. con HIV+)
• '128 casi/100,000 abitanti
• Oltre un milione di morti all'anno La tubercolosi è una patologia riemergente nei Paesi Occidentali WHO Global Tuberculosis Control Report

In Emilia-Romagna la situazione rimane più o meno stabile negli anni.

Nonostante sia una patologia che si conosce da centinaia di anni, la tubercolosi rimane un' importante causa di morte nel mondo.

Ogni anno muoiono di questa malattia circa un milione di persone, sui 9 milioni che presentano una tubercolosi attiva. Questa è solo la punta dell'iceberg, infatti, circa 2,5 miliardi di persone vengono esposte a questi micobatteri. C'era stato un calo tra gli anni '50 e la fine degli anni '80, che però non si è protratto nel tempo; anzi, negli ultimi anni si sta osservando un leggero aumento della mortalità a causa dell'emergenza di nuovi ceppi resistenti a vari farmaci e anche a causa del fatto che siano colpite sempre più alcune categorie fragili come gli immunocompromessi.

Parete Batterica del Mycobacterium Tuberculosis

Parete batterica Essendo un micobatterio, la sua parete batterica è ricca in lipidi, i quali conferiscono alcool-acido resistenza, resistenza a molti farmaci e a detergenti, inoltre portano a una crescita lenta. Il tempo di replicazione stimato in vitro è di una o mezza giornata; tuttavia è difficile fare una stima reale di quello che avviene in vivo.

In particolare nella parete troviamo dall'interno verso l'esterno: un sottile strato di peptidoglicano, poi arabino- galattani a cui sono ancorati gli acidi micolici e infine lipo-arabino-mannani. Questi ultimi attraversano tutta la parete per ancorarsi direttamente al peptidoglicano.

• Dall'interno verso l'esterno sono presenti peptidoglicano, arabinogalattano e glicolipidi di superficie dove si ancorano gli acidi micolici. I lipo-arabinomannani sono ancorati direttamente alla membrana e attraversano per intero tutta la parete.
• Tale complessità giustifica la resistenza ai fattori ambientali (essiccamento), l'alcool-acido resistenza, l'elevato tempo di replicazione (12-24 ore), la particolare antigenicità (dovuta alla componente proteica della parete), la resistenza a molti antibiotici e la tendenza del batterio all'aggregazione

Glicolipidi fenolici Lipoarab inomannan cer Mycolic Acid Arabinogalactan Peptidoglycan Cytoplasmio Membrane M. tuberculosis cell wall

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Colorazione di Ziehl-Neelsen Per la loro messa in evidenza nei materiali patologici si usa la colorazione di Ziehl-Neelsen in cui si sfrutta la capacità di resistere alla decolorazione con alcool addizionato di HCl.

Spesso nei referti invece di micobatteri si può trovare la denominazione BARR, cioè bacilli alcool-acido resistenti.

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Procedura della Colorazione di Ziehl-Neelsen

Come si fa la colorazione di Zieh-Neelsen? Non è una colorazione semplice, ma complessa, ovvero a più step. Sul vetrino vengono fatte aderire sospensioni batteriche se si parte da una coltura, oppure viene strisciato direttamente il materiale patologico sul vetrino. Si lascia asciugare poi si esegue la fissazione, ovvero si cerca di Organismo distruggere la parete in modo tale che le colorazioni possano penetrare al loro interno. La fissazione può avvenire con Batteri acido-resistente sospesi in l'effetto del calore o di alcuni alcoli.

Dopo la fissazione si mette il vetrino a contatto con un colorante rosso, generalmente la fucsina. Si lascia agire il colorante per alcuni minuti e poi si fa una decolorazione con alcool e HCl al 3%. Questo tipo di passaggio toglie il colorante rosso a tutti i normali batteri sia Gram+ sia Gram - perché l'HCl è in grado di penetrare sia lo strato di peptidoglicano spesso dei Gram+ sia la membrana esterna dei Gram -. Quindi tutti i batteri si decolorano ad eccezione dei micobatteri, che rimangono rossi.

Per poter leggere il vetrino si usa un nuovo colorante blu, generalmente il blu di metilene, che colora tutto il resto, come cellule eucariotiche eventualmente presenti nel preparato e tutti gli altri batteri Gram+ e Gram- . Gli unici batteri rossi saranno quindi i BARR.

La colorazione di Ziehl-Neelsen Organismo non acido-resistente fisiologica e fissati sul vetrino Carbol-fucsina e fenolo 3 min e sciacquare con H2O Decolorare con HCI 3% in alcool 70% 2min e sciacquare con H2O Blu di metilene 30 sec sciacquare con H2O e asciugare

Fattori di Virulenza dei Micobatteri

Fattori di virulenza:

• Posso considerare come carattere di virulenza anche la parete stessa, così spessa, poiché impedisce l'azione di molti antibiotici. I beta-lattamici che agirebbero sulla sintesi del peptidoglicano non sono infatti utili contro i micobatteri per via dello strato di lipidi impenetrabile.

Non hanno la capsula, che in altri batteri è un fattore di virulenza in quanto contribuisce alla formazione del biofilm, il quale elude il sistema immunitario e interferisce con l'ingresso di alcuni antibiotici.

Non producono tossine (altro elemento che se presente nei batteri può essere considerato fattore di virulenza). MBT infatti non emette esotossine all'esterno e, non essendo un Gram-, non presenta al suo interno endotossina.

I veri fattori di virulenza dei micobatteri della tubercolosi sono quindi :

• Resistenza al killing intracellulare: la parete impedisce il killing all'interno dei macrofagi. I macrofagi riescono a fagocitare i micobatteri, ma in realtà nella maggior parte dei casi non riescono poi effettivamente a ucciderli. Così i micobatteri riescono a sfuggire al sistema immunitario nascondendosi proprio all'interno dei macrofagi.
• Fattore cordale: ne permette l'agglutinamento, formando ammassi di micobatteri che sono difficili da eliminare dal sistema immunitario perché è impedita addirittura la fagocitazione stessa.

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