Domande di microbiologia: batteriologia generale e patogeni

Domande Microbiologia

Batteriologia Generale

N.B. MANCA COULD

1. Antibiogramma L'antibiogramma (test di Kirby-Bauer) è un metodo utile per determinare contemporaneamente, l'efficacia di più antibiotici contro una specifica specie batterica; per fare un antibiogramma, occorre coltivare su una piastra (con terreno adatto) una quantità di batteri adatta a formare una patina uniforme. Sulla piastra, quindi, si posizionano dei dischi circolari di carta assorbente imbevuti di antibiotici diversi, che diffonderanno e impediranno più o meno efficacemente la crescita batterica in una zona circolare, la cui ampiezza è legata alla sensibilità del microrganismo a quello specifico farmaco. Questa area sarà visibile come un alone chiaro e limpido in contrasto con l'intorbidamento del resto della coltura. Dopo il periodo di incubazione, si andrà a valutare la zona attorno ai dischi ("alone di inibizione"): maggiore sarà l'area e maggiore sarà l'efficacia del farmaco. Le indicazioni fornite dall'antibiogramma non sono comunque assolute, perché possono non rispecchiare le condizioni in cui il batterio si trova in vivo. Il metodo standard usato per determinare l'efficacia di un antibiotico nei confronti di un determinato batterio consiste nella determinazione della cosiddetta MIC, o la minima concentrazione inibitoria, ovvero la minima dose di farmaco necessaria per inibire la crescita batterica. Minore è la MIC, più potente è il farmaco. Per ogni antibiotico esiste una specifica MIC. Un altro valore importante da tenere in considerazione perché permette di comprendere se il farmaco ha effetto batteriostatico o battericida è la MBC, o la minima concentrazione battericida, che rappresenta la quantità minima di farmaco per uccidere una determinata specie batterica. In genere, un farmaco battericida presenta valori simili di MIC e MBC. Per calcolare la MIC si può eseguire un test di sensibilità agli antibiotici per diluizione. Un test che si posiziona a metà tra i due precedenti è invece il test epsilometrico (E-test)

Parete Cellulare Batterica

2. Parete cellulare La parete cellulare è un ulteriore rivestimento che si trova esternamente alla membrana plasmatica delle cellule. Nelle cellule eucariotiche è assente o formata da chitina questo perché tali cellule nell'uomo, per esempio, vivono in un contesto d'organo; nelle cellule procariotiche, come i batteri, invece la parete è una struttura complessa contenente proteine, lipidi e peptidoglicano perché tali cellule vivono in un ambiente più ostile. La parete batterica rappresenta l'interfaccia tra batterio e ambiente esterno: possono quindi donare al batterio "impermeabilità" a certe sostanze (tra cui gli antibiotici). È lo strato che si occupa della protezione del microrganismo, perché la membrana plasmatica, in quanto strato fosfolipidico, è piuttosto labile e quindi facilmente distruttibile dagli agenti esterni. La parete batterica, al contrario, è una struttura rigida di rivestimento che conferisce la forma al batterio e lo protegge, rendendo i batteri estremamente resistenti agli agenti fisico-chimici (resistenza non assoluta): è una sorta di esoscheletro per la cellula batterica. È una struttura vitale per i batteri, infatti esistono una serie di antibiotici che interferiscono con la sintesi di questa. Se viene inibita la sintesi della parete, i batteri muoiono in quanto non resistono alla differenza di pressione osmotica tra interno ed esterno (scoppiano). I batteri sono capaci di vita autonoma se hanno il corpo batterico completo compresa la parete batterica che li protegge bene dall'esterno, altrimenti diventano parassiti intracellulari obbligati, questi esistono e sono causa di patologie umane anche importanti. Esempio: clamidie hanno una parete batterica irregolare e di conseguenza non possono replicarsi in ambiente esterno perché morirebbero, diventano quindi parassiti intracellulari obbligati. La composizione della parete batterica, variabile, viene usata per la classificazione dei batteri (intesa anche come diagnosi); inoltre, essendo esterna, può essere colorata tramite agenti coloranti. La parete determina le caratteristiche basilari del batterio in termini antigenici, e inoltre è lo strato più esterno, quello riconosciuto dal sistema immunitario e quindi sarà molto importante anche per la generazione di vaccini; essa contiene molti PAMPs, patogen associated patterns, ovvero molecole riconosciute dai PRR (pattern recognition receptor), posseduti dalle cellule dell'immunità immediata, innata e adattiva, ritardata. Tutto ciò che costituisce il corpo batterico ha risvolti patogenetici, di reazione e di diagnostica diversi. Da notare che la parete batterica è presente in circa l'80% dei batteri patogeni che colpiscono l'uomo. Esistono quindi delle eccezioni. Tra queste troviamo soprattutto i Micoplasmi e i micobatteri (due gruppi totalmente diversi): i micoplasmi sono batteri atipici, con una parete ricca di steroli; la parete batterica dei micobatteri, invece, presenta sì il peptidoglicano (che però è un componente minimo) ma il vero spessore della parete è data da una struttura di tipo ceroso (arabino-mannani, arabino-galattani, acidi micolici e glicolipidi fenolici) con una caratteristica impermeabilità. Questi batteri si possono colorare solo con coloranti particolari e scaldandoli, per permette lo "scioglimento" dello strato ceroso. Una composizione così specifica è sinonimo di una permeabilità particolare: sono pochi gli antibiotici che possono andare ad attaccare i micobatteri, penetrando attraverso la parete.La colorazione della parete batterica è fondamentale per il riconoscimento dei batteri; esiste infatti una colorazione: la colorazione di Gram, una colorazione differenziale. La reattività a questa colorazione permette di distinguere la stragrande maggioranza dei batteri (anche se alcuni non risultano reattivi ad essa: micobatteri e micoplasmi). Si distinguono due gruppi:

• Gram positivi
• Gram negativi

La differenza tra i due gruppi è basata proprio sulla composizione delle due differenti pareti batteriche: i Gram positivi, infatti, presentano la parete composta da uno strato spesso di peptidoglicano; nei Gram negativi invece, lo strato di peptidoglicano è molto più ridotto e lo ritroviamo all'interno di un spazio denominato spazio periplasmatico, esternamente, troviamo una membrana esterna costituita da lipopolisaccaridi e proteine. Alla fine della colorazione, i batteri possono assumere due colori:

• Viola e blu: Gram (+)
• Rosati: Gram (-)

Gram positivi processo di fissazione chimica Gram negativi Fissazione al calore Cristal violetto Trattamento con iodio Decolorazione Colorante di contrasto Per colorare i batteri occorre metterli su un vetrino e fissarli (usando sostanze chimiche che li uccidono): si utilizza quindi un colorante blu (cristalvioletto) a cui si aggiunge il lugol (che serve a fissare il cristal violetto); si fisserà molto meglio nel caso dei batteri Gram positivi, perché hanno uno spesso strato di peptidoglicani che possono assorbire il cristalvioletto. Alla fine di questi due passaggi tutti i batteri sono sul blu: si trattano quindi i batteri con acido e alcool (decolorazione) che porta i Gram negativi a perdere il colore (perché il petpdicoglicano non ha assorbito il colore, vista la presenza della membrana esterna). Si esegue quindi la colorazione di contrasto (o contro colorazione), usando la fucsina o la safranina (di colore rosa). Alla fine di tutto ho distinto i batteri in Gram positivi e Gram negativi. La colorazione di Gram è utilizzata ancora oggi.

Parete Cellulare dei Batteri Gram Negativi

3. Parete cellulare dei batteri gram - La parete cellulare dei batteri gram- è un rivestimento più sottile rispetto a quella dei Gram+, definito come un tri-layer, ovvero costituito da:

1) la membrana plasmatica (detta membrana interna), costituita a sua volta da un doppio strato fosfolipidico simmetrico. 2) uno strato di peptidoglicano molto ridotto, di 20-30 Å non strettamente collegato ma immerso in uno spazio reale, detto spazio periplasmico. Tale spazio non è un luogo inerte ma all'interno sono presente molteplici enzimi "modificanti" o detossificanti, ovvero hanno molteplici attività enzimatiche che controllano tutto ciò che entra nel batterio, proteggendolo; possono rendere inattivi gli antibiotici, modificandoli chimicamente, con metilazioni, degradazioni ecc. Questo conferisce perciò forte resistenza ai batteri Gram- agli antibiotici. 3) esternamente vi e la membrana esterna, presente solo nei Gram negativi. Questa membrana è ancorata alla parete da lipoproteine e strutture proteiche denominate Porine, le quali consentono anche la diffusione passiva di componenti idrofili di piccole dimensioni (caratteristica molto importante in quanto tale mebrana è idrorepellente, ovvero lo strato lipidico la rende altamente impermeabile alle componenti idrofiliche/solubili). La membrana esterna è bilaminare ma asimmetrica, ovvero presenta due foglietti fosfolipidici ma diversi tra loro: il foglietto esterno è costituito prevalentemente da fosfolipidi, il foglietto interno è costituito prevalentemente da LPS, lipopolisaccaridi, che rappresentano la componente endotossica dei Gram -. I Gram- risultano resistenti al lisozima e sono poco sensibili ai farmaci che bloccano la sintesi del peptidoglicano, come la penicillina, poiché questi non possono attraversare la membrana; tuttavia rimangono sensibili al complesso del complemento.

Sintesi del Peptidoglicano

4. Sintesi di peptidoglicano Il peptidoglicano è il maggior componente della parete batterica; è una macromolecola presente solo nei batteri (per questo motivo è un forte PAMP) e la cui produzione è determinata da enzimi specifici e quindi, in quanto specifici, potranno essere target di eventuali farmaci.Il peptidoglicano è un reticolato rigido che presenta una struttura chimica particolare: è un enorme polimero formato dalla ripetizione di un'unità basale dimerica di acido N-acetilmuramico (NAM) e N-acetil glucosammina (NAG), legati da un legame beta-glicosidico (1-4): si forma così una catena. Il NAM poi è legato a una catena peptidica di quattro amminoacidi (diversi in base alla specie batterica) sintetizzata come penta-peptide, tuttavia l'ultimo aa viene perso per fornire l'energia alla formazione di un legame trasversale. Le singole catene, infatti, si legano anche tra di loro con ponti trasversali che legano un NAM all'altro. Questi legami trasversali tra catene adiacenti prendono il nome di legami di transpeptidazione e sono creati dagli enzimi transpeptidasi. I legami possono essere diretti tra catene tetrapeptidiche (tra l'amminoacido lisina in terza posizione di un peptide e la Dalanina in quarta posizione dell'altro peptide) come accade nei Gram -, oppure mediati da una pentaglicina tra le due catene amminoacidiche, come accade nei Gram +. Il risultato è una struttura estremamente compatta, a forma di rete. I precursori iniziali vengono prodotti a livello del citoplasma, la sintesi del peptidoglicano si completa durante il suo trasporto verso la membrana e poi successivamente , grazie al bactoprenolo, viene legati e inseriti a livello della parete batterica che si sta allungando. Il peptidoglicano è la componente principale dei Gram positivi e rappresenta lo strato più esterno. Diversa è la situazione dei Gram negativi: il peptidoglicano è sempre presente, ma ha uno spessore minore e si trova interposto nello spazio periplasmico (o periplasma), tra due membrane fosfolipidiche (quella plasmatica, o interna, e quella esterna). Esistono enzimi, in alcuni liquidi bilogici, come il lisozima che possono attaccare la parete batterica, degradando il peptidoglicano. Di conseguenza, i Gram (+) sono altamente suscettibili al lisozima. La penicillina, invece, blocca la formazione dei legami crociati per il peptidoglicano, di conseguenza va a indebolire più i Gram (+) rispetto ai Gram (-).

Lipopolisaccaride (LPS)

5. LPS Il LPS è una tossina dei batteri Gram (-) ed è uno dei responsabili della azione patogena di questi batteri. Quindi, in presenza di LPS, sapremo certamente che si tratta di batteri Gram negativi. Il LPS è costituito da una parte lipidica e una saccaridica: la struttura base è comune a tutti i batteri Gram negativi; è la porzione esterna, saccaridica, che determina le diverse tossicità e rappresenta anche i diversi antigeni che distinguono le diverse specie di batteri. Troviamo quindi dall'interno verso l'esterno: LIPOPOLISACCARIDE (LPS) OUT CATENA LATERALE O · Antigene-O · Altà variabilità n CORE · Eptoso · Acido desossioctonoico LIPIDE A IN . Disaccaride fosforilato · Acidi grassi - il lipide A, costituito da un dimero di NAG fosforilata a cui si legano acidi grassi a lunga catena; rappresenta la porzione responsabile dell'attività endotossica dell'LPS; - la porzione saccaridica costante (core), un oligosaccaride in cui sono presenti uno zucchero a 8C (acido chetodeossioctonoico) e uno a 7C (eptoso); - la porzione saccaridica ipervariabile, o antigene O, un polisaccaride costituito dalla ripetizione di zuccheri a 3/4/5C, che è responsabile della specificità antigenica e permette la classificazione sierologica dei Gram (-); le catene polisaccaridiche sono in grado di legare cationi bivalenti (come il Mg++) che formano ponti tra le catene stesse conferendo compattezza alla membrana esterna. LPS è anche detto endotossina perché può legarsi a recettori che mediano l'attività infiammatoria delle cellule eucariotiche; nelle cellule eucariotiche del sistema immunitario innato, infatti, abbiamo i recettori PRR (o Patter Recognition Receptors), che riconoscono i PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns) e, quindi, riconoscono gli agenti patogeni. Quindi, il LPS va a legarsi ai recettori Toll-like-receptor 4, che porta alla produzione di citochine pro-infiammatorie. La reazione iniziale di una cellula a un patogeno, quindi, è sempre infiammazione.

Differenza tra Esotossine ed Endotossine

6. Differenza tra esotossine e endotossine Le esotossine

• sono per lo più peptidi a elevato peso molecolare,
• sono prodotti di sintesi dei batteri (prodotte nel citoplasma e secrete all'esterno).
• Non sono dei veri e propri PAMPs perché non sono riconosciuti dai PRR.
• Non inducono febbre nell'ospite
• sono termolabili, (per esempio la tossina botulinica non dà mai botulinismo con un cibo cotto o riscaldato bene perché è termolabile)
• sono antigeniche
• possono essere convertite in tossoidi per l'allestimento dei vaccini.
• sono molto tossiche per gli animali da laboratorio, in quantità misurabili in ug.