Esercitazione di microbiologia sulla preparazione di terreni di coltura

Preparazione di Terreni di Coltura per Batteri

ESERCITAZIONE MICROBIOLOGIA 11-03-22

Che cosa dobbiamo creare in questo ambiente (in vitro) per far crescere un batterio? Per far crescere un qualsiasi organismo è necessario fornirgli: cibo (le sostanze nutritive), acqua, temperature idonee, ossigeno.

Prima si facevano procedimenti abbastanza lunghi per produrre i substrati dove poter far crescere i batteri. Adesso abbiamo tutto confezionato (abbiamo una bustina contenente una polverina), quello che dobbiamo fare noi è prendere soltanto un po' di acqua e sospendere in una beuta la polverina.

La beuta avrà un particolare tipo di vetro, infatti in laboratorio si utilizzano sempre strumenti in vetro pyrex (un vetro che non si spacca), non possiamo utilizzare un vetro che abbiamo a casa perché questi strumenti devono essere sterilizzati, quindi trattati a temperatura alta.

Possiamo utilizzare l'acqua del rubinetto? No, perché non è sterile e non è deionizzata. Quindi noi utilizziamo un'acqua che è distillata perché altrimenti ci possono essere degli scambi di ioni che possono interferire con i nostri microrganismi.

Quindi cosa si fa? Si prende la bilancia analitica e si misura la polverina desiderata che poi si versa nella beuta. Si versa la quantità di acqua e si porta a far sciogliere mettendolo su una piastra (un "fornello"). Questo perché inizialmente la polverina non era sospesa bene, quindi dobbiamo farla sciogliere bene, senza far bollire o far bruciare la soluzione.

Dopodiché li portiamo nell'autoclave e li facciamo sterilizzare.

Domanda: "Ma la quantità di polverina e di acqua è sempre la stessa oppure cambia?" Risposta: "La quantità cambia sulla base delle quantità che noi necessitiamo. Ad esempio, in un litro si sciolgono 51 grammi. Se ho bisogno di fare mezzo litro (in base a quante piastrine devo fare, cioè in base a quanto materiale mi serve per poter seminare) dovrò mettere una quantità inferiore di polverina. Per esempio, se hai un determinato tipo di batterio e ti serve un terreno particolare, tu non fai 1 l neanche mezzo l, ma fai 200g. Perché ti serve una quantità minore. Non sprechi il prodotto inutile. Per quei terreni che utilizziamo più spesso in laboratorio (come McConkey o MSA) ne prepariamo una quantità molto maggiore perché si usano ogni giorno"

Se dobbiamo utilizzare una beuta non la chiudiamo con il tappino. Mettiamo ovatta sigillata con una garza, in modo tale che quando andiamo a sterilizzare, il vapore che esce deve poter passare.

Tipi di Terreni di Coltura

Sulla base chimica i terreni possono essere: liquidi e solidi.

Terreni Solidi e Agar

Per diventare solido cosa si mette? Si mette l'Agar, che è un polisaccaride che deriva dall'agarose e ci serve per far diventare il brodo di coltura solido.

Per quale motivo dovrei rendere solido il mio terreno? Se noi mettiamo un qualsiasi tampone in un terreno liquido, cosa vediamo dopo 24 ore? Risposta "che è diventato torbido"Esatto. Diventa solo torbido. Nel tampone liquido non possiamo vedere nient'altro. Quindi lo facciamo per poter vedere la morfologia della colonia, aspetto, come tratta il substrato.

Crescita di Batteri Aerobi e Anaerobi

La maggior parte dei batteri che arrivano in laboratorio arrivano su un terreno liquido, perché così permettiamo agli aerobi di crescere e svilupparsi in superficie, mentre gli anaerobi vanno in profondità.

Se dobbiamo creare una piastra con batteri anaerobi, dobbiamo creare condizioni per anaerobi.

בג Come la facciamo? Mettendoli nelle giare (vedi foto), creando una condizione di microaerofila. Mettiamo i campioni nella giara e inseriamo una bustina contenente dei reagenti che permettono, tramite una reazione chimica, di bruciare tutto l'ossigeno e creare la condizione di anaerobiosi. Prima quando non c'era questa modernità si mettevano le candele che consumavano l'ossigeno. Questo procedimento si effettua per batteri che sono anaerobi, microaerofili (cioè organismi esigenti di poco ossigeno ed elevate concentrazione di CO2) e anaerobi facoltativi

Mentre, gli organismi esigenti di ossigeno (batteri aerobi) vanno messi in termostato.

Componenti dei Terreni di Coltura

COMPONENTI DI UN TERRENO DI COLTURA Un brodo di base contiene acqua e sale

Importanza del Sale

Perché dobbiamo mettere il sale? Per equilibrare l'osmoticità.

Domanda "Devo metterne un valore preciso?" "Ci sono dei valori specifici, delle "ricette". Sulle istruzioni è riportata, per ogni terreno, la quantità di sale necessaria."

Gestione dei Campioni in Laboratorio

Quando arrivano i campioni noi non sappiamo che tipi di batteri ci siano, però ogni campione ha un numero identificativo, ogni campione viene protocollato. Se dobbiamo seminare dobbiamo scrivere sulla piastra: data, numero identificativo, e le nostre iniziali.

Scrittura sulle Piastre

Perché si scrive soltanto ai bordi della piastra e non al centro? Risposta: "Perché altrimenti non vedo. Serve per una visibilità maggiore"

Perché i terreni si appoggiano sempre in un determinato verso? Perché non al contrario? Risposta: "Per evitare che si aprano quando li vado a prendere, dato che si aprono sempre in un verso."

Perché scriviamo sempre sullo stesso lato della piastra (ovvero sempre nella parte che rimane "a terra", sul piano dove sto lavorando, quando li apro)? Risposta: "Per evitare di scambiare i campioni con altri. Se dobbiamo lavorare contemporaneamente su più piastre, potremmo invertirle. Per questo dobbiamo scrivere sempre dove c'è l'agar."

Raffaello Colotta

Terreni Nutritivi e Arricchiti

Terreni nutritivi di base contengono:

• acqua;
• sodio;
• peptoni.

Se abbiamo dei microrganismi esigenti parliamo di terreni arricchiti; in questo caso il terreno arricchito è l'agar sangue che si prepara con aggiunta di sangue nel nostro terreno.

Preparazione dell'Agar Sangue

Quando preleviamo sangue da un animale e lo dobbiamo mettere nel terreno bollente appena uscito dallo sterilizzatore questo deve essere defibrinato perché altrimenti si crea il coagulo ma a noi servono, per poter creare un terreno di agar sangue, gli eritrociti senza fibrinogeno e quindi lo andiamo ad eliminare.

Per eliminare il fibrinogeno devo usare queste palline di vetro, si preleva il sangue dall'animale, (pecore, capre, conigli ecc. in base alla richiesta del microrganismo) si posiziona in questi contenitori e si sciacqua energicamente andando ad eliminare il fibrinogeno. A questo punto possiamo prelevare gli eritrociti e aggiungerli nel terreno pronto.

Cosa succede se la temperatura supera i 50°? Si spaccano gli eritrociti perciò appena uscita dall'autoclave prendiamo la provetta e la mettiamo a bagnomaria, aspettiamo che si stempera e poi sotto la cappa si manovra e si distribuisce nella piastra.

Terreni Selettivi

Oltre ai terreni arricchiti abbiamo anche i terreni selettivi: cosa significa? Questi sono terreni selettivi ci permettono di far crescere un singolo gruppo di batteri. Uno si utilizza per far crescere Enterobacteriaceae (MacConkey) e uno per far crescere stafilococchi (Mannitol Salt Agar). Abbiamo composizione diversa: in Mannitol Salt Agar abbiamo aggiunta di sale molto alta perché uccide tutti i batteri ad eccezione degli stafilococchi che sono estremamente resistenti e solo loro riescono a crescere in queste condizioni.

Mannitol Salt Agar (MSA)

21.01 PROVA PUREZA IMSA Mannitol Salt Agar E' un terreno selettivo e differenziale usato per gli stafilococchi con un 7,5% NaCl (% che inibisce tutti i batteri tranne gli Stafilococchi che sono alofili). Contiene mannitolo e peptoni (substrati) e rosso fenolo (indicatore di pH). I batteri fermentanti il mannitolo producono acidi, si abbassa il pH, le colonie sono gialle sul fondo del terreno. Se non c'è l'utilizzazione del mannitolo non vi è il viraggio del colore: colonie incolori. Quindi potremo avere una piastra mannitolo positiva o una mannitolo negativa.

MacConkey Agar

TAND TALTA LACt -xO Kck OK + GRADE LAC - 589/21 -X0 PICCOLA MacConkey Invece quando si stratta di enterobatteriacee abbiamo una piastra così (vedete il colore). se sono lattosio positivi sono così (bordeaux, piastra centrale dell'immagine) se sono lattosio negativi rimane così (prima piastra a partire da sotto, quella rossiccia). Enterobatteriacee fermentano lattosio e questo cambia il colore che passa ad un rosa intenso. I batteri che non hanno gli enzimi preposti per la digestione del lattosio utilizzano laltra fonte nutritiva nel terreno, i peptoni, da cui catabolismo sono prodotte le ammine. In questo caso il terreno non cambia colore. Le colonie di batteri lattoso positivi appaiono di colore rosa intenso, quelle lattoso negative restano incolore.

Differenze di Colore nei Terreni Selettivi

Il colore del terreno cambia perché in quella gialla (Mannitol Salt Agar) vi è stata la fermentazione del mannitolo: si produce acido lattico, questo acidifica il terreno e questa è data dal viraggio del colorante che sta dentro. Questo grazie al colorante che si chiama rosso fenolo che come il pH si alza di poco, la fermentazione fa cambiare colore al terreno.

Anche nel McConkey abbiamo lo stesso principio: la fermentazione del lattosio produce acido lattico che provoca l'acidificazione del terreno e produce questo colore rosa intenso. Nell'altro caso, invece, non digeriscono il lattosio ma usano i peptoni presenti nel terreno che producono delle ammine e alcalinizzano il terreno. Quindi in base al batterio che cresce avremo una colorazione diversa.

Ci sono batteri che usano il lattosio e altri no, alcuni usano i peptoni e quindi producono le ammine che determinano un aumento del pH e vediamo la reazione del colore nel terreno.

Domanda: Tra i due terreni cambia la composizione, in base a cosa scegliamo un terreno piuttosto che l'altro? In base alla colonia? Quando arriva un campione e non sappiamo che cos'è, lo seminiamo sui diversi terreni selettivi.

Nell'agar sangue cresce tutto. Se cresce solo sul Mannitol Salt Agar vuol dire che è stafilococco. Se cresce sul McConkey è un enterobatteriacee.

Identificazione Batterica

Sulla base dei cambiamenti andiamo ad identificare nel modo più veloce i diversi batteri. II secondo step è la colorazione gram (positiva o negativa),e il terzo è fare la pcr. I passaggi sono questi. Quando arriva il campione dobbiamo sapere in che direzione seminiamo.

Tecniche di Semina

Guardiamo come è stato seminato questo terreno: T I SID TIT Il campione quando si prende si preleva una colonia e si stempera. Poi si parte in una direzione fino a metà, si gira la piastra, si fa la seconda, poi si può fare anche la terza e infine fare due serpentine. Questo serve per distribuire le colonie per poter vedere una colonia singola come appare perché quando stemperiamo avremo una crescita maggiore e non si può identificare la morfologia della colonia.

Angelica Scaltrito

Intorno alle colonie è possibile vedere la lisi degli eritrociti.

Per eseguire una semina serve un'ansa, questa deve essere sterilizzata e poi fatta raffreddare prima all'aria e poi nel terreno di coltura per evitare di uccidere i batteri.

Si preleva un batterio e poi si pone nel nuovo terreno di coltura.

Si divide la capsula in 2 sezioni. Si parte dalla sezione 1 e si deposita il batterio muovendo l'ansa in orizzontale e scendendo.