Replicazione del DNA: polimerasi, mutazioni e farmaci antivirali

Biochimica, Lezione 31, 21/11/2023

Prof.ssa Maria Letizia Penolazzi
REPLICAZIONE DEL DNA - 2ª PARTE

La prof inizia la lezione ribadendo alcuni concetti visti in precedenza legati all'azione della DNA polimerasi
Nel guardare insieme la chimica della reazione che sta alla base della polimerizzazione, cioè realizzazione di
una nuova emielica di DNA, abbiamo visto tutte le problematiche che possono derivare dal fatto di non avere
il desossiribonucleotide giusto messo nel posto giusto; quindi l'importanza di avere un sistema che viene
garantito dalla DNA polimerasi che per la propria conformazione è tale che riesce a distinguere
tendenzialmente chi sta appaiando con l'emielica stampo.
Grazie a questa sua capacità di discriminazione, garantisce il fatto che non vengano inseriti così
frequentemente gli errori. Questo viene garantito da un sistema fatto di residui amminoacidici, due aspartati
negativi, e dalla capacità di coordinare questi cationi bivalenti, in particolare il Magnesio. Questo caso da una
parte ha reso possibile la reazione in quanto tale,
dall'altra la conformazione propria della DNA
polimerasi rende possibile il fatto di inserire solo il
desossiribonucleotide che effettivamente, anche per
caratteristiche steriche, è in grado di occupare una
posizione specifica dell'emielica perché è in grado di
creare quei 2 o 3 legami a idrogeno necessari perché
avvenga un appaiamento corretto.

Processività della DNA Polimerasi

Caratteristiche della DNA Polimerasi

Abbiamo anche visto, nelle caratteristiche di una DNA
polimerasi e legato anche alla frequenza con cui vengono
inserite le mutazioni, il concetto di processività, ovvero la capacità che ha la DNA polimerasi di inserire dei
nucleotidi prima di staccarsi e come questa proprietà possa essere implementata grazie sliding clamp, proteine
con funzione strutturale che fanno in modo che la DNA polimerasi non si sposti dal luogo di replicazione.
Parlando di mutazioni che possono insorgere al momento della replicazione, ci sono eventi che avvengono con
meno frequenza, dato che vengono attuate diverse strategie per limitare gli errori, come la fedeltà di
replicazione: quasi tutte le DNA polimerasi attuano sia l'attività esonucleasica 5'-3', ovvero la capacità di
correggere eventuali errori che si presentano andando avanti con la replicazione, sia l'attività esonucleasica
3'-5', la capacità di tornare indietro e correggere un eventuale desossiribonucleotide inserito erroneamente.
Questa capacità è detta proof reading e grazie ad essa la frequenza delle mutazioni viene ridotta molto, fino a
10-7. Ci sono diverse altre strategie da attuare, in caso le due modalità precedenti non fossero efficaci.

Tipi di mutazioni e tautomeria

1Abbiamo visto anche i vari tipi di mutazioni che ci possono essere, partendo dalle problematiche legate alla
tautomeria cheto-enolica, per cui, ad esempio, invece che avere la forma cheto-, veniva inserita la forma
enol- e quindi gli appaiamenti venivano inseriti in modo sbagliato, oppure il processo di deaminazione; sono
eventi spontanei, che però possono essere riconosciuti dato che si parla di basi particolari riconosciute come
non adeguate dalle molecole nelle quali sono state inserite e vengono rimosse. Tra le più diffuse c'è la citosina
che viene trasformata in uracile che non deve essere presente nel DNA, quindi viene considerata come non
adeguata e rimossa.

Metilazione

Processo di metilazione e mutazioni

L'altro punto su cui abbiamo riflettuto è la metilazione, il fatto che un
evento può avvenire anche solo per una necessità che fisiologicamente
o patologicamente la cellula può avere per rendere inaccessibile
alcune zone del DNA durante il processo di trascrizione.
Questo processo permette di trasformare delle citosine in
metilcitosine. La problematica è che mentre la deaminazione di una
citosina, che diventa uracile, viene identificata ed eliminata, la deaminazione di una metilcitosina origina una
timina, che quindi viene considerata adeguata alla molecola di DNA nascente e di conseguenza si crea una
mutazione. Più del 30% delle mutazioni che possono avvenire per sostituzione all'interno del nostro DNA
avvengono per questo motivo.

Deaminazione della citosina e 5-metilcitosina

a) Deamminazione della citosina a uracile
b) Deamminazione della 5-metilcitosina (5™C) a timina

Depurinazione e riparazione cellulare

Un altro evento che può capitare, legato alle mutazioni, è la
depurinazione, la perdita di una purina. In questo caso, però, la
cellula è in grado di rimediare all'errore prontamente per evitare
interruzioni nella replicazione

Fattore casualità delle mutazioni

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Va considerato chiaramente anche il fattore casualità: se la
mutazione interessa una zona poco interessante non si hanno grossi
problemi, mentre se interessa una zona specifica e comporta
l'aggiunta o la scomparsa di un sito di splicing, oppure il cambio
dell'amminoacido determinante per la funzione della proteina,
allora si avranno conseguenze importanti.

Danni ad opera di agenti chimici

Etilmetansolfonato (EMS) e alchilazione

Altri danni che possono ricorrere all'interno di nucleotidi sono
legati ad altri agenti chimici, per esempio l'etilmetansolfonato,
che si trova nei pesticidi: in seguito all'esposizione può avvenire
una trasformazione che porta ad una forma di guanina modificata
mediante alchilazione che, a causa dell'ingombro creato, non va più ad interagire con la citosina bensì con la
timina.

Specie reattive dell'ossigeno (ROS)

Altri agenti che possono portare a modificazioni sono i cosiddetti ROS (specie reattive
dell'ossigeno), in grado di trasformare la guanina in ossiguanina, che non ha più
necessariamente complementarietà con una desossicitosina ma
potrebbe avvenire anche con una desossiadenina; si crea di
conseguenza una trasversione GCTA e possono insorgere
problematiche legate a queste mutazioni.
I principali ROS sono:
• O2- (anione superossido)
• O2H (radicale idroperossido)
• OH (radicale idrossilico)

Danni ad opera di agenti fisici

Luce ultravioletta (UV) e dimeri di timina

In seguito ad esposizione anomala alla luce ultravioletta (UV), si possono
generare dei dimeri di timina, dei collegamenti tra le due timine sotto
forma di anello, che le rende indivisibili e di conseguenza la replicazione
non può più avvenire in modo corretto. Anche in questo caso ci sono sistemi
che le riconoscono e le eliminano. Viene ribadita l'importanza di avere un
sistema che sia capace di correggere gli errori.

Raggi gamma e raggi X

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Anche i raggi gamma e i raggi X sono in grado di provocare in modo assolutamente casuale dei tagli del
DNA, con conseguente rottura del doppio filamento. Anche questi eventi possono essere facilmente riparati,
prima tramite riconoscimento e poi successivamente recuperati grazie alle ligasi; in ogni caso non possono
essere frequenti altrimenti il sistema di riparo non riesce
a stare al passo dei danni che vengono a formarsi.

Agenti intercalanti

Meccanismi di danno e mutagenicità

Altri meccanismi che possono causare danni alla doppia elica del
DNA, che in realtà non modificano la sequenza dell'emielica bensì
la sua struttura, sono gli agenti intercalanti.
Alcuni di questi vengono utilizzati in biologia molecolare, come il
bromuro di etidio che si usa nell'elettroforesi su gel dato che emette
fluorescenza se esposto a raggi UV e quindi rende visibile la
migrazione del DNA nel gel.
Questi agenti sono quindi vantaggiosi per le tecniche di biologia molecolare, ma hanno un'elevata capacità
mutagena per cui, soprattutto in cellule che si replicano velocemente, possono alterare la struttura
tridimensionale dell'emielica e causare l'inserimento di errori.

Farmaci che inibiscono la replicazione

Effetti collaterali della chemioterapia

Nel momento in cui è necessario inibire la vitalità o la funzionalità di un determinato organismo, di un virus,
di un batterio, o di cellule impazzite del nostro organismo, un buon metodo è colpire ed alterare la replicazione
del DNA; per fare ciò sono disponibili diversi farmaci.
Gli effetti collaterali della chemioterapia sono legati al fatto che i farmaci colpiscono tutti quei sistemi biologici
caratterizzati da una notevole capacità di proliferazione come azione mantenitiva di questi tessuti, per esempio i
bulbi piliferi dei capelli, la linea bianca ematica (linfociti e monociti), le cellule del tratto intestinale o quelle a
livello dermico. Colpiscono quindi le cellule che, fisiologicamente, compiono un lavoro costante, quindi si replicano
tanto. E' importante trovare quindi dei farmaci che siano in grado di colpire esattamente la cellula che interessa
escludendo tutte le altre, per un effetto incondizionato di inibizione della replicazione.

Inibitori della timidilato sintasi e ribonucleotide reduttasi

La biodisponibilità di desossiribonucleotidi è strettamente collegata all'attività della timidilato sintasi o della
ribonucleotide reduttasi, un enzima che trasforma i ribonucleotidi difosfato in desossiribonucleotidi.
La ribonucleotide reduttasi ha un proprio inibitore, l'idrossiurea, che se usato permette quindi di colpire tutto
l'apparato che riguarda la replicazione.

Aciclovir e chinasi virale

Un altro esempio è l'azione dell'Aciclovir, un farmaco che è stato individuato per riuscire a colpire in modo
mirato solo le cellule colpite dall'infezione virale. L'Aciclovir, come tale, non è in grado di funzionare, ma si
deve trasformare in Aciclovir trifosfato che è abbastanza simile e potrebbe ingannare un enzima che può
scambiarlo per una desossiguanosina.
Questa molecola può diventare forma attiva, cioè trifosfato, solo se viene attaccata da queste chinasi. La chinasi
più efficace è la timidina chinasi virale, quella con una maggiore affinità per l'Aciclovir: per questo il farmaco
funzionerà solamente nelle cellule che hanno la timidina chinasi virale, ovvero le cellule che hanno subito
l'infezione.
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