Proteomica HPLC: Cromatografia liquida ad alte prestazioni all'Università

Proteomica #Nº4 HPLC

Prof. Magni - Data Lezione (2/3/2021) - Autore sbobina: Lorenzo de Leonardis - Revisore: Noorhan Sherif Continuiamo a prendere consapevolezza di quali sono i fattori che entrano in gioco in un processo cromatografico, indipendentemente da quelli che sono i principi su cui fase stazionaria e fase mobile interagiscono per ripartire l'analita.

Nel caso di una condizione cromatografica che non ci va bene, come abbiamo visto, la condizione migliore su cui possiamo tentare di agire inizialmente è l'aumento del numero di piatti teorici: questo lo possiamo ottenere semplicemente allungando la lunghezza della colonna ... in questo modo però aumenta il numero di piatti teorici ma aumenta anche il tempo di ritenzione. L'altra possibilità è invece quella di diminuire l'altezza del piatto teorico, in modo tale da avere un numero di piatti teorici maggiore a parità di lunghezza di colonna. Questo mi permette di mantenere inalterato il tempo di ritenzione.

Vediamo ora perché abbiamo questo allargamento di banda e come possiamo contenerlo ... Dobbiamo cercare di capire cosa accade a livello molecolare all'interno di un sistema cromatografico. Se osserviamo le particelle che stanno nella zona tra le due fasi (mobile e stazionaria), dopo un tot di ore possiamo concludere che ogni particella di analita si muove all'interno di questa zona e durante questo movimento è soggetta a migliaia di scambi reciproci tra fase mobile e fase stazionaria. Tuttavia, il tempo con cui avvengono questi scambi è variabile: se una particella va dalla fase stazionaria alla fase mobile e non ha sufficientemente energia per muoversi rimane lì, mentre una particella che ha molta più energia si muove più rapidamente e dà luogo a più possibilità di passare da fase mobile a fase stazionaria.

Teoria cinetica della cromatografia

Mobile Phase ]Stationary Phase a.Analyte 3 Mobile Phase Stationary Phase lum distribution with no flow -Equilibrium distribution ration profile Flow- Phase insertace - Absorption & desorption (omusion) Fig. 6.6. In this example the analyte molecules (3) obtain an approximate 4060 equilibrium dis- tribution across the mobile-sutionary phase interface.

1. Bland broadening due to mass transfer. Analyses diffusing from the mobile to the stationary phase at the front of the shihed zone and from the stationary to the mobile phase at the rear of the zone result in hand broad

• Una particella di analita, durante il movimento è soggetta a molte migliaia di scambi tra la fase mobile e quella stazionaria.
• Il tempo che essa trascorre in ciascuna fase dopo ogni trasferimento è molto irregolare e dipende dalla possibilità fortuita che essa guadagni dal suo intorno sufficiente energia termica da dar luogo al processo inverso.

Inoltre, la particella si muove all'interno della colonna solo quando è nella fase mobile, quando è nella fase stazionaria sta ferma. Le particelle che si trovano all'apice della curva indicata avranno meno possibilità di passare da fase mobile a stazionaria rispetto a quelle che si trovano nella zona di contatto tra le due fasi. In sintesi, alcune particelle si scambiano più velocemente e altre più lentamente a seconda della loro energia cinetica e della loro posizione.

La conseguenza di questi processi casuali è che c'è una dispersione simmetrica delle velocità attorno al valore medio: il fatto che le particelle si muovano più o meno velocemente fa sì che la banda si allarghi. L'ampiezza della banda aumenta durante il tragitto lungo la colonna, perché vi è più tempo affinché avvenga questa dispersione: più rimangono, più il picco si allarga.

Absorption & desorptionQuindi noi saremmo portati a concludere che meno l'analita rimane in colonna, meno si disperde (e meno si allarga il picco). Quindi ci verrebbe da concludere che un modo per far sì che il picco sia stretto è quello di aumentare la velocità della fase mobile: più la fase mobile si muove velocemente, più le molecole di analita permangono nella colonna meno a lungo e il picco rimane stretto.

Ora vediamo se questa affermazione è corretta o meno.

Van Deemter cercò di capire quali fossero gli attori che determinavano l'altezza del piatto teorico ... ci sono 3 fattori che entrano in gioco:

• A = coefficiente di diffusione microvorticosa B = coefficiente di diffusione longitudinale C = resistenza al trasferimento di massa dove u è la velocità della fase mobile (da cui B/u e Cu).

Forma dei picchi

• La conseguenza di questi singoli processi casuali è una dispersione simmetrica delle velocità attorno al valore medio, che rappresenta il comportamento più comune della particella media.
• L'ampiezza della banda aumenta durante il tragitto lungo la colonna perché vi è più tempo affinchè avvenga la dispersione .. QUINDI: Meno permane in colonna MENO si disperde, MENO si allarga il picco ... QUINDI AUMENTIAMO LA VELOCITA' DELLA FASE MOBILE! ?

Variabili cinetiche che influenzano l'allargamento della banda (N-H)

• Relazione tra l'altezza del piatto teorico e i parametri modificabili della colonna:
• A = Coefficiente di diffusione microvorticosa (molteplici percorsi)
• B/u = Coefficiente di diffusione longitudinale
• Cu = Resistenza al trasferimento di massa (tempo di equilibrazione)

van Deemter equation for plate height: H =A+-+Cu u 4 Multiple paths Longitudinal diffusion Equilibration time

A = diffusione microvorticosa

Le nell'immagine abbiamo una sezione di colonna cromatografica dove i pallini bianchi sono la fase stazionaria e le molecole dell'analita si muovono nello spazio lasciato libero dalla fase stazionaria.

A = Diffusione microvorticosa (Eddy diffusion) 1 1 2 2 3 18 3 0 Time Ci sono alcune molecole di analita (molecola · EFFETTO: le molecole seguono cammini diversi all'interno della colonna + per cui lo stesso composto arriva in tempi diversi ad attraversare la stessa lunghezza della colonna. numero 3) che sono molto "fortunate", perché essa compie il percorso da testa a coda della colonna utilizzando il percorso più breve, mentre HETP (cm) la particella numero 1 incontra molto più ostacoli in questo "labirinto" di spazio vuoto lasciato dalle · OTTIMIZZAZIONE: omogeneizzazione dell'impaccamento e delle dimensioni U (cm /sec) delle particelle del riempimento. molecole della fase stazionaria e utilizza quindi il percorso più lungo > la molecola numero 1 sarà quella che esce per ultima, mentre la molecola numero 3 sarà quella che esce per prima (ovviamente la maggior parte delle molecole utilizzerà un percorso intermedio più simile alla numero 2).

Quindi la banda è larga perché abbiamo percorsi diversi: abbiamo il percorso più lungo, quello più corto e poi una serie di percorsi intermedi variabili.

In questo caso, l'aumento della velocità della fase mobile (u) può limitare questa diffusione?

• No, perché la velocità aumenta per tutte le molecole e quindi il percorso più breve rimane comunque più breve e quello più lungo rimane comunque più lungo ... aumentando la velocità di scorrimento della fase mobile le molecole escono ad un tempo di ritenzione inferiore, ma il picco si allarga sempre (vedi nella slide l'allargamento del picco nella curva dopo la corsa cromatografica).

Quindi l'altezza del piatto teorico non è influenzata dalla velocità della fase mobile.

Per ottimizzare questo fattore, il compito in questo caso è di chi costruisce la fase stazionaria: dovrà cercare di costruire una colonna dove la differenza tra percorso più grande e percorso più piccolo sia la minore possibile.

B = diffusione longitudinale

Diffusione Longitudinale (B / u) Come vediamo nell'immagine, abbiamo il picco cromatografico all'inizio della colonna (in rosa) e man mano che questo si sposta si allarga sempre di più.

• EFFETTO: fenomeni di diffusione da parte delle molecole del soluto nella fase mobile (carrier) a seguito di gradienti di concentrazioni locali.

Zone of solute after short time on column Longitudinal diffusion (B/ux) HETP (cm) Per capire questo fenomeno, Zone of solute after longer · AZIONE: aumentare la viscosità del gas di trasporto. time on column pensiamo di avere una bottiglia d'acqua e di aggiungerci una goccia di vino rosso: possiamo osservare che Direction of travel all'inizio ho una superficie sferica colorata di rosso che poi nel tempo scompare ... questo accade perché nel Velocità lineare della fase mobile (cm/seco vino ci sono delle molecole colorate di rosso che si muovono e spontaneamente (per il terzo principio della termodinamica) tendono all'entropia, cioè al disordine in quanto il disordine è quel sistema in cui la quantità di energia libera è minore. Quindi queste molecole che si muovono tendono ad espandersi verso l'esterno, dove c'è minor concentrazione rispetto all'interno.

Allo stesso modo, nella colonna cromatografica se noi lasciamo il nostro analita per un tot di tempo, questo nel tempo si espanderà e quindi il picco andrà ad allargarsi perché le molecole si dissolvono > più a lungo lascio la fase mobile nella fase stazionaria, più le molecole si dissolveranno.

È per questo motivo che, a differenza di prima, qui incide anche la velocità di scorrimento della fase mobile (u) e in particolare agisce in modo inversamente proporzionale (B/u). Più precisamente, nel caso della diffusione longitudinale le molecole tendono a disperdersi o verso sinistra o verso destra e quindi il picco si allarga: però il fatto che la fase mobile scorra fa in modo che mentre le molecole tendono a disperdersi, la fase mobile impedisce alle molecole di disperdersi nella direzione longitudinale > più la fase mobile scorre velocemente minore sarà questo fenomeno di diffusione e quindi il picco rimarrà più compatto.C = resistenza al trasferimento di massa.

C = resistenza al trasferimento di massa

Il nostro analita è ripartito in una parte nella fase mobile e una parte nella fase stazionaria, ma come vediamo nell'immagine la fase mobile spinge il nostro analita in avanti mentre la fase stazionaria rimane ferma.

Se il processo di riaggiustamento dell'equilibrio fosse istantaneo, noi non avremmo questo fenomeno. Quanto più la fase stazionaria ritarda questo riequilibrio dovuto allo slittamento della porzione mobile di analita, ovvero la fase stazionaria oppone resistenza al trasferimento della massa dell'analita che c'è in fase stazionaria e fase mobile, tanto più la banda si allarga.

Resistenza al trasferimento di massa (Cu)

• La resistenza al trasferimento di massa è legata alla difficoltà che le molecole del soluto trovano nel loro movimento di avanzamento all'interno della colonna.
• Il termine C è quindi la somma della resistenza al trasferimento di massa nella fase mobile (CM) e nella fase stazionaria (Cs)

Mobile Direction phase of elution Stationary phase Bandwidth Slow equilibration € Bandwidth after some travel Velocità lineare della fase mobile (cm/sec)

Anche qui ci chiediamo ... l'aumento della velocità di scorrimento della fase mobile (u) come impatta su questo fenomeno? In questo caso impatta in modo direttamente proporzionale: se muovo la fase mobile più velocemente verrà accentuato lo sfalsamento della fase mobile sulla stazionaria e quindi la banda si allarga.

Ora abbiamo preso consapevolezza dei 3 attori che determinano l'altezza del piatto teorico ... van Deemter isolò questi 3 fattori e li studio singolarmente, ma la risultante è la somma di tutti i 3 fenomeni.

Come vediamo nel grafico:

• la diffusione microvorticosa (A) è una costante
• la diffusione longitudinale (B/u) diminuisce all'aumentare della velocità
• il tempo di equilibrio (C-u) aumenta all'aumentare della velocità

La curva in rosso ci dice che c'è UN valore della velocità della fase mobile (u, qua espresso in mL/min) che è ottimale, considerando tutti questi fattori contemporaneamente.

Van Deemter: Velocità verso Efficienza

10 9 8 7 Plate height (mm) 6 A 是 + Cux 4 3 Equilibration time Cux 2 A Multiple paths 1 Longitudinal diffusion B Ux 0 20 40 60 80 100 120 Flow rate (mL/min)

L'equazione di van Deemter ci serve proprio per stabilire qual è questo valore ottimale di velocità della fase mobile ... se vado al di sotto questo valore aumento l'altezza del piatto teorico (asse y) e quindi diminuisco il numero di piatti teorici totali, ma anche se vado troppo al di sopra di questo valore rischio poi di aumentare l'altezza del piatto teorico.

HETP (cm)

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