Determinazione delle proteine negli alimenti: metodi e applicazioni

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Corso di Laurea: Insegnamento: Numero lezione: Titolo: Psicologia Determinazione della Proteine

Perché si determina il contenuto proteico negli alimenti?

Conoscere il quantitativo delle sostanze proteiche, che vengono assunte, può essere importante per diverse finalità. Ad esempio, un consumatore consapevole troverà sicuramente utile conoscere quante proteine ingerisce mangiando un certo quantitativo di prodotto alimentare; oppure un venditore può ritenere strategico riportare sull'etichetta nutrizionale, da apporre sulla confezione di vendita, l'indicazione del tenore proteico ed, eventualmente, la percentuale degli amminoacidi essenziali contenuti.

Analisi quantitative

Diversi metodi per la quantificazione delle proteine totali che si basano su

1. Determinazione dell'azoto;
2. Dosaggio spettrofotometrico diretto;
3. Metodi colorimetrici.

Determinazione dell'azoto e contenuto proteico

Il contenuto proteico di un alimento che è riportato nelle etichette nutrizionali viene di norma determinato in base al suo tenore in azoto. Le proteine sono macromolecole biologiche, formate da una o più catene amminoacidiche che contengono al loro interno un gruppo funzionale amminico (un composto 1 C 2007 - 2016 Università degli Studi eCampus - Via Isimbardi 10 - 22060 Novedrate (Co)- C.F. 9002752130 - Tel: 031.79421 - Fax: 031.7942501 - Mail: info@uniecampus.ite CAMPUS UNIVERSITÀ Corso di Laurea: Insegnamento: Numero lezione: Titolo: Psicologia dell'azoto). Il contenuto di azoto nelle proteine oscilla tra il 15.5% e il 18.9% (vedi tabella).

Metodo Kjeldahl

Il contenuto proteico di un alimento è valutato dal suo tenore in azoto, determinato con il. Il metodo Kjeldahl valuta la maggior parte dell'azoto presente nell'alimento, esclusi i nitrati, i nitriti, e taluni composti azotati ciclici. Le proteine vengono quantificate moltiplicando il contenuto di azoto totale per un fattore che in genere è 6.25. Il fattore 6,25 è stato scelto ipotizzando per tutte le proteine un tenore di azoto del 16% (100/16=6,25); nel caso delle proteine del latte, il fattore moltiplicativo da usare è 6,38, mentre è 5,7 per il grano, la segale e i loro prodotti sfarinati.

Step analitici del metodo Kjeldahl

Sono previsti tre step analitici:

• Digestione del materiale a caldo con acido solforico e conversione dell'azoto organico in solfato d'ammonio non volatile (a).
• Neutralizzazione del digerito con una base (in eccesso) formando ammoniaca (b), distillata ed intrappolata come ammonio in una soluzione di acido borico (in quantità nota) (c).
• L'acido borico restante viene retro-titolato con NaOH 2 C 2007 - 2016 Università degli Studi eCampus - Via Isimbardi 10 - 22060 Novedrate (Co) - C.F. 9002752130 - Tel: 031.79421 - Fax: 031.7942501 - Mail: info@uniecampus.ite CAMPUS UNIVERSITÀ Corso di Laurea: Insegnamento: Numero lezione: Titolo: Psicologia moli NH3 = moli totali acido- moli di NaOH consumate (acido non reagito) (d I risultati vengono indicati come % o mg di azoto, che può essere convertito in proteine utilizzando fattori di conversione (che è pari a 5,7 per il grano, la segale e i loro sfarinati, mentre è 6,25 per tutti gli altri prodotti alimentari).

Assunzioni e limitazioni del metodo Kjeldahl

Il metodo Kjeldahl assume che tutto l'azoto presente nell'alimento sia sotto forma proteica In realtà una piccola percentuale di L'azoto non proteico può derivare da amminoacidi liberi, piccoli peptidi, acidi nucleici, fosfolipidi, ammino zuccheri, vitamine, ioni ammonio ecc ... Quindi l'azoto totale quantificato con questo metodo è dato dalla somma di : azoto proteico (maggior parte) + azoto non proteico (solubile, aminico)

Vantaggi del metodo Kjeldahl

Vantaggi

1. Applicabile a tutti i tipi gli alimenti
2. Economica
3. Accurata 3 C 2007 - 2016 Università degli Studi eCampus - Via Isimbardi 10 - 22060 Novedrate (Co)- C.F. 9002752130 - Tel: 031.79421 - Fax: 031.7942501 - Mail: info@uniecampus.ite CAMPUS UNIVERSITÀ Corso di Laurea: Insegnamento: Numero lezione: Titolo: Psicologia
4. Metodo modificato anche per misurare microgrammi di proteine
5. Può essere automatizzato

Svantaggi del metodo Kjeldahl

Svantaggi

1. Misura l'azoto totale, non solo quello di origine proteica
2. Richiede molto tempo (almeno 2 ore)
3. Precisione minore rispetto ai metodi colorimetrici
4. Impiega reagenti pericolosi

Dosaggio spettrofotometrico diretto

L'assorbimento nella regione dell'ultravioletto è un valido e veloce metodo per determinare la concentrazione di una proteina pura, di cui si conosce la sequenza aminoacidica. Nel vicino UV, a 2= 280 nm, assorbono gli aminoacidi aromatici, triptofano, tirosina e in misura minore la fenilalanina. L'intensità di assorbimento ad una certa lunghezza d'onda permette di ricavare informazioni di tipo quantitativo. L'assorbanza è definita come: A=log 10/I dove I0 = intensità della luce che colpisce il campione I = intensità della luce trasmessa dal campione 4 C 2007 - 2016 Università degli Studi eCampus - Via Isimbardi 10 - 22060 Novedrate (Co)- C.F. 9002752130 - Tel: 031.79421 - Fax: 031.7942501 - Mail: info@uniecampus.ite CAMPUS UNIVERSITÀ Corso di Laurea: Insegnamento: Numero lezione: Titolo: Psicologia Secondo la legge di Lambert-Beer l'assorbanza è proporzionale alla concentrazione della soluzione analizzata: A= Ebc dove b = cammino ottico espresso in cm C è la concentrazione proteina. 8 = coefficiente di estinzione molare, definito come l'assorbanza di una soluzione 1 M della sostanza in esame ad una data lunghezza d'onda, usando un cammino ottico di 1cm. La legge di Lambert-Beer, può essere applicata solo a soluzioni diluite. Metodo semplice vantaggioso: permette il riutilizzo del campione esaminato. Si basa sulla determinazione dell'assorbanza a 280 nm (triptofano, tirosina e fenilalanina). L'assorbimento varia in base alla composizione in aa della proteina. Svantaggio: limitazione di specificità e precisione. In genere, per miscele di proteine si utilizza la seguente formula. mg proteine/ml = 1,55 * A280 -0,76 * A260 A260 = assorbanza a 260 nm, dovuta agli acidi nucleici 5 C 2007 - 2016 Università degli Studi eCampus - Via Isimbardi 10 - 22060 Novedrate (Co)- C.F. 9002752130 - Tel: 031.79421 - Fax: 031.7942501 - Mail: info@uniecampus.ite CAMPUS UNIVERSITÀ Corso di Laurea: Insegnamento: Numero lezione: Titolo: Psicologia

Metodi colorimetrici

Basati sulla formazione di complessi colorati di proteine con alcuni reattivi.

Principali metodi colorimetrici

Principali metodi:

1. Metodo del Biureto
2. Metodo di Lowry
3. Metodo di Bradford (o del Blue Coomassie)

Metodo del Biureto

Aggiungendo alla soluzione proteica una soluzione rameica in ambiente basico, si ottiene una colorazione viola-porpora con un max assorbimento a 540 nm. Dovuto alla formazione di un complesso tetra-coordinato del rame con legami peptidici (es. biureto, peptidi e proteine): il rame viene poi ridotto

Applicazioni del metodo del Biureto

Applicazioni in campo alimentare: E' stato usato per determinare il contenuto proteico in cereali, carne, soia, concentrazione di proteine isolate e come test qualitativo per il cibo animale.

Vantaggi del metodo del Biureto

Vantaggi

1. Meno costoso del metodo di Kjeldhal, più rapido e semplice.
2. Poche sostanze di natura non proteica interferiscono con il dosaggio.
3. Non dosa l'azoto da sorgenti non proteiche o non peptidiche.

Svantaggi del metodo del Biureto

Svantaggi 6 C 2007 - 2016 Università degli Studi eCampus - Via Isimbardi 10 - 22060 Novedrate (Co)- C.F. 9002752130 - Tel: 031.79421 - Fax: 031.7942501 - Mail: info@uniecampus.ite CAMPUS UNIVERSITÀ Corso di Laurea: Insegnamento: Numero lezione: Titolo: Psicologia

1. Poco sensibile rispetto ad altri metodi (almeno 2-4 mg di proteine per saggio).
2. Alte concentrazioni di sali d'ammonio interferiscono con il dosaggio.
3. Il colore può variare a seconda delle proteine (la gelatina dà una reazione rosa-porpora).
4. La soluzione può essere opalescente a causa di alto contenuto di lipidi e carboidrati.
5. Non è un metodo assoluto: necessaria una curva di taratura (e.g. con BSA

Metodo di Lowry

Combina la reazione del biureto con la riduzione del reattivo fosfomolibdico- fosfotungstico per i fenoli, il reattivo di Folin-Ciocalteau. Gli ioni rameosi prodotti dai legami peptidici, e le tirosine e triptofani delle proteine reagiscono con il reattivo di Folin formando un colore blu (750 nm), per la formazione di blu di tungsteno e blu di molibdeno

Applicazioni del metodo di Lowry

Applicazioni: Viene usato soprattutto in campo biochimico, data la sua semplicità e sensibilità. In campo alimentare non è usato spesso: prima necessita di una estrazione delle proteine 7 C 2007- 2016 Università degli Studi eCampus - Via Isimbardi 10 - 22060 Novedrate (Co)- C.F. 9002752130 - Tel: 031.79421 - Fax: 031.7942501 - Mail: info@uniecampus.ite CAMPUS UNIVERSITÀ Corso di Laurea: Insegnamento: Numero lezione: Titolo: Psicologia

Vantaggi del metodo di Lowry

Vantaggi

1. Molto sensibile: 50-100 volte più sensibile del biureto; 10-20 volte più sensibile dell'assorbimento UV.
2. Meno sensibile alla torbidità del campione.
3. Più specifico di altri metodi.
4. Semplice (1-1,5 ore per il dosaggio).

Svantaggi del metodo di Lowry

Svantaggi

1. Il colore può variare a seconda della proteina maggiormente rispetto al biureto.
2. Il colore non è strettamente proporzionale alla concentrazione proteica.
3. Diverse sostanze interferiscono (saccarosio, lipidi, fosfati, monosaccaridi).
4. Alte concentrazioni di zuccheri riducenti, solfato d'ammonio, e composti sulfidrilici interferiscono con la reazione 8 C 2007- 2016 Università degli Studi eCampus - Via Isimbardi 10 - 22060 Novedrate (Co)- C.F. 9002752130 - Tel: 031.79421 - Fax: 031.7942501 - Mail: info@uniecampus.ite CAMPUS UNIVERSITÀ Corso di Laurea: Insegnamento: Numero lezione: Titolo: Psicologia

Metodo di Bradford (o del Blue Coomassie)

Sfrutta l'uso di un colorante, il Coomassie Brilliant Blue G250. Quando si lega alle proteine, cambia colore da rossiccio a blu con il massimo di assorbimento a 595 nm. Si lega alle catene laterali degli amminoacidi basici (positivi, interazioni elettrostatiche) e aromatici (interazioni idrofobiche) cambiando lo spettro di assorbimento rispetto al colorante non legato

Applicazioni del metodo di Bradford

Applicazioni: In campo alimentare, è stato usato per determinare le proteine nella birra, nel mosto e nelle patate. Usato in campo biochimico per la quantificazione grazie alla sua buona sensibilità, rapidità e minor interferenze rispetto al Lowry.

Vantaggi del metodo di Bradford

Vantaggi

1. Rapido: reazione completa in 2 minuti.
2. Riproducibile.
3. Sensibile.
4. Nessuna interferenza da ammonio solfato, polifenoli, carboidrati, o cationi come K+, Na+ ed Mg2+. 9 C 2007 - 2016 Università degli Studi eCampus - Via Isimbardi 10 - 22060 Novedrate (Co)- C.F. 9002752130 - Tel: 031.79421 - Fax: 031.7942501 - Mail: info@uniecampus.it