Biotecnologie biomediche: lezione sulla terapia genica IV

Biotecnologie Biomediche: Terapia Genica IV

BIOTECNOLOGIE BIOMEDICHE
LEZIONE IV
TERAPIA GENICA IVDisclaimer
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La Prima Morte Causata dalla Terapia Genica

La prima morte causata dalla terapia genica
Prima del settembre 1999 si pensava che la terapia genica somatica per la cura di malattie
gravi fosse un'opzione terapeutica corretta da un punto di vista etico. Nel caso di una
malattia mortale o terminale si riteneva che i potenziali benefici superassero i costi e i rischi
di un tale approccio. Il primo caso di morte per terapia genica dovuto ad una risposta
iperimmune del paziente ha cambiato però l'opinione generale.
Il paziente era un ragazzo di 18 anni affetto da una forma lieve di
deficit di ornitina transcarbamilasi (OTC), enzima mitocondriale
del ciclo dell'urea necessario alla detossifcazione dell'ammoniaca
(nel FEGATO). Questo difetto era controllato con farmaci ed una
dieta molto stretta per evitare l'accumulo tossico di ammoniaca
(neurotossicità, gravi deficit neurologici).
Al paziente fu somministrata una dose di vettore adenovirale
ricombinante (con OTC) nella vena porta.
Il paziente ricevette 38 miliardi di miliardi di particelle, la dose più
alta mai somministrata. Anche così solo l'1% delle particelle
raggiunse il fegato e non si osservò espressione significativa del
gene.
Le particelle invasero tutti gli organi e 4 giorni dopo il paziente
morì per una risposta infiammatoria sistemica alle proteine virali
che portò a insufficienza generalizzata degli organi. Da allora le
regole dell'FDA sono diventate molto più strette per il
trattamento sperimentale con terapia genica e i ricercatori e le
istituzioni che la praticano hanno responsabilità molto più
elevate.

2 ATP + HCO, + NH3
NH2
C
2 ADP. P.
NH
0
CH:
citrullina
CH2
H2NOPO32.
P
CH2
HC-NHỊ*
ČOO
1
3
1
3
1
NH,
ATP
CH2
ornitina
H2
ASS
CH2
L-Asp
HC-NH3
Čoo
AMP
1
HẠN
N. H.COO
ARG1
NH
NH
CH2
CH2
CH2 COO
HẠN
NH2
H2O
CH2
urea
CH2
HC-NH3"
HC-NH3"
Čoo
COO
ČOO
arginina
CH
HC fumarato
COO
3
1
- PP
CH2
ASL
CH2
arginino-
succinato
1 CPS-1
carbamil-P
2
OTC
H2N _NH2

Terapia Genica della Fibrosi Cistica

TERAPIA GENICA DELLA FIBROSI CISTICA
La fibrosi cistica rappresenta una patologia ideale per la terapia genica. Infatti la malattia è
monogenica, recessiva e si manifesta principalmente in un organo, il polmone che è facilmente
raggiungibile anche ripetutamente da una via di accesso naturale, tutte condizioni ideali per la
terapia genica.
La fibrosi cistica (FC) è causata da una mutazione del gene CFTCR (Cystic Fibrosis
Transmembrane Conductance Regulator) che codifica una proteina di membrana di 250 KDa
delle cellule epiteliali, appartenente alla famiglia dei trasportatori ABC, la cui funzione è quella di
esportare il cloro regolata da cAMP.
È la malattia genetica ereditaria mortale più comune nella popolazione caucasica (1 su 1800).
Si conoscono circa 1400 diverse mutazioni. La più frequente è una delezione di una tripletta, che
provoca la perdita dell'aminoacido fenilalanina codificato dal codone 508 (delta F508).
Si ha un'anomalia nel trasporto del cloro nella membrana delle
cellule delle ghiandole a secrezione esterna. Esse secernono un
muco denso e vischioso (poca acqua).
Negli organi interessati principalmente apparato respiratorio e
gastroenterico, il muco determina un'ostruzione dei dotti
principali, provocando l'insorgenza di infezioni polmonari
ricorrenti, di insufficienza pancreatica, di stati di malnutrizione.
L'aspettativa di vita oggi è raggiungere i 50 anni, e la qualità della
vita è veramente modesta.
La maggior parte dei pazienti muore per compromissione
dell'apparato respiratorio e l'attuale terapia si basa sul
mantenimento delle vie aeree il più libere possibile dal muco
limitando le infezioni e farmaci che mirano a correggere il
difetto.

Meccanismo della Fibrosi Cistica

Carboidrato
Pora
ATP
ATP
Dominio
che lega
il nucleotide
Sito della
delezione
comune di
fenilalanina
Cloro
Dominio
che lega
il nucleotide
Fosfato
Dominio
regolatore
Citoplasma

Sperimentazioni Cliniche per la Fibrosi Cistica

Il gene CFTR è stato clonato nel 1989 e negli anni '90 la malattia è stata oggetto di molte
sperimentazioni di terapia genica.
In particolare furono compiuti 25 studi clinici di fase I/II che coinvolsero più di 400 pazienti con
adenovirus somministrati nelle vie aeree superiori con spray nasali. Gli studi volevano stabilire
l'efficienza nell'epitelio nasale come surrogato del polmone. Purtroppo l'utilizzo di adenovirus è stata
fallimentare sia per l'elevata risposta immunitaria dei pazienti, anche grave, sia la scarsa espressione del
recettore per il virus nell'epitelio polmonare, quindi la terapia venne abbandonata.
I ricercatori si sono quindi concentrati su vettori AAV, in trials clinici sia di fase I (sicurezza) che di fase II
(sicurezza ed efficacia). A parte pochi casi in cui si evidenzia un buon trasferimento del DNA a breve
termine (almeno 30 giorni) e produzione della proteina ricombinante nelle cellule nasali, nella maggior
parte dei pazienti il trattamento ha avuto esito negativo portando l'industria biotecnologica statunitense
che aveva lanciato la terapia a interrompere gli studi nel 2005.
Più recentemente ci sono state una decina di
sperimentazioni con vettori non virali.
Questi studi hanno dimostrato che questi sistemi
di trasferimento possono portare ad una
ricostituzione della funzione di CFTR del 25% del
normale. I sistemi non virali come liposomi o
lipidi cationici possono essere somministrati
ripetutamente in modo da migliorare nel tempo
l'efficienza di trasferimento.
Questi sistemi sono attualmente impiegati i
alcune estese sperimentazioni cliniche sostenute
prevalentemente dalle associazioni dei pazienti
affetti negli Stati Uniti e nel Regno Unito.

Vettori Non Virali per la Fibrosi Cistica

Cationic liposome
Plasmid containing
normal CFTR gene
Direct fusion with
cell membrane
Nebuliser
Endocytosis
Trachea
Airway
cell
-Lungs
Endosomal
incorporation
followed by
escape
O
Plasmid
DNA enters
into the
nucleus
Nucleus
CFTR
gene
XXXXXX®
CFTR is transcribed
into mRNA, which exits
the nucleus and is
translated to produce
CFTR proteins. The
proteins move to the
cell membrane and
restore lost function.
mRNA
CFTR protein

Terapia Genica delle Distrofie Muscolari

TERAPIA GENICA DELLE DISTROFIE MUSCOLARI
Lo sviluppo di metodologie che consentano il trasferimento di
geni sicuro ed efficace nel muscolo scheletrico è molto
perseguito poiché il muscolo è il tessuto in cui si manifestano
una serie di difetti ereditari spesso gravi di proteine che
collegano il citoscheletro alla matrice extracellulare tali da
portare allo sviluppo di varie forme di distrofia.
Il muscolo anche può rappresentare un'importante sede di
rilascio di proteine terapeutiche nel trattamento di difetti
ereditari a carico della componente solubile del sangue (es
fattori coagulazione).
Le distrofie muscolari congenite comprendono un gruppo
eterogeneo
di
gravi
malattie
neuromuscolari
e
neurodegenerative, che causano atrofia progressiva della
muscolatura scheletrica. Sono noti nove principali difetti (DMD,
BMD, Emery-Dreifuss, Distrofia dei cingoli ecc.) ma in realtà ci
sono più di 100 malattie diverse che hanno aspetti simili.

Struttura del Muscolo e Distrofina

Collagen in basal lamina
Laminin
Dystrophin-associated
complex
a-DG
Sarcoscan.
B-DG
Sarcolemma
Dystrophin
Actin
Cytoplasm
Muscle fiber
Sarcolemma
membrane
I geni che causano distrofia muscolare codificano per proteine che collegano il citoscheletro interno alla
cellula alla matrice extracellulare stabilizzando il sarcolemma e inviando importanti segnali intracellulari,
sono principalmente la Distrofina e le proteine ad essa associate.
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è la più frequente con un'incidenza di circa 1:3500 bambini
maschi. Si trasmette per via ereditaria recessiva, legata al sesso (gene sul cromosoma X). Difetti dello
stesso gene caratterizzano anche la distrofia muscolare di Becker (BMD) che ha un'incidenza inferiore
1:20000 e un decorso più mite.

Distrofina e Proteine Associate

DISTROFINA E PROTEINE ASSOCIATE
La distrofina è una lunga proteina filamentosa (427 KDa) che
si trova sul versante citoplasmatico della membrana delle fibre
muscolari
striate
particolarmente
nelle
giunzioni
neuromuscolari.
La proteina è composta da 4 domini:
-regione N-terminale (ABD, actin binding domain)
-un dominio a bastoncello centrale composto da una serie di
ripetizioni di 3 alfa-eliche simili alla spectrina
-un dominio ricco di cisteine (CR)
-una regione C-terminale (CT)
La regione ABD si lega ai filamenti di actina mentre il dominio
CR è essenziale per legare sul sarcolemma un complesso di
proteine denominato «complesso di glicoproteine associate
alla distrofina>> DGC. Il complesso ha il compito di connettere
il citoscheletro interno alla matrice extracellulare, stabilizzando
il sarcolemma mentre la fibra si allunga e si accorcia.

Domini della Distrofina

a
Dominio a bastoncello
CR CT
NH2
COOH
ripetizione simile alla spectrina
regione cerniera

Complesso di Glicoproteine Associate alla Distrofina (DGC)

b
Laminina
Matrice
extracellulare
u-DG
a-SG &-SG
‹‹
3666
008
Citosol
Sarcospan Caveolina-3
Distrofina
Sintrofine
Distrobrevina
NOS
Filamenti di actina
c
Dominio a bastoncello
ABD
00000-0000
DMD
Dominio a bastoncello
ABD
CR CT
000 000000
BMD
La distrofina e le proteine DGC sono anche importanti mediatori di segnali intracellulari. Sia
nell'uomo che negli animali la mancanza di distrofina causa anche la carenza secondaria delle
proteine DGC sul sarcolemma.
Il DGC è composto da più di dieci proteine. La componente centrale è il DISTROGLICANO. Un
altro gruppo di proteine che fanno parte del complesso DGC è quello dei SARCOGLICANI.
Infine per ultime troviamo la DISTROBREVINA e le SINTROFINE (si associano al dominio CT
della distrofina).

Componenti del Complesso DGC

ABD
Collagene
P-DG Y-SG -SG