Técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo primarias

Técnicas basadas en Ag-Ac primarias

U.D- 3: Técnicas basadas en reacciones Antígeno - Anticuerpo primarias

1. Las técnicas basadas en Ag-Ac primarias.

Marcadores y clasificación de inmunoensayos

1. Las técnicas basadas en Ag-Ac primarias.
2. 1- Los marcadores.
3. 2- Clasificación de los inmunoensayos.

Inmunocromatografías

1. Inmunocromatografías.
2. 1- Inmunocromatografía para la detección de Ag.
3. 2- Inmunocromatografía para la detección de Ac.

Enzimoinmunoensayos

1. Enzimoinmunoensayos.
2. 1- Inmunoensayos enzimáticos multiplicados (EMIT).
3. 2- Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA).

Fluoruinmunoensayos

1. Fluoruinmunoensayos.
2. 1- Técnicas de inmunofluorescencia.
3. 2- Fluoroenzimoinmunoensayos.

Radioinmunoensayos

1. Radioinmunoensayos.
2. 1- Tipos de radioinmunoensayos.
3. 2- Variante de los RIA.

Técnica Western Blot

1. Técnica western blot.
2. 1- Inmunotrasnferencia, inmunoblotting o western blot.

Sistemas adicionales de revelado

LA1. Las técnicas basadas en Ag-Ac primarias. 1.1 Los marcadores Las reacciones antígeno anticuerpo primarias no producen manifestaciones visibles que permitan evidenciar sus resultados positivos, lo cual hace necesario el uso de sistemas adicionales de revelado.

¿Qué son los sistemas adicionales de revelado?

LOS MARCADORES Moléculas que actúan como marcador en reacciones Ag-Ac primarias. Estas moléculas se deben unir a Ag o Ac complementario al que se desea determinar, sin alterar su capacidad de unirse al anticuerpo o antígeno de la muestra.

Características de los marcadores

1. Las técnicas basadas en Ag-Ac primarias. 1.1 Los marcadores Una de las características de los marcadores más importante es la facilidad de detectar y medirlos. Para ello se utilizan sistemas de amplificación de señales.

Según las características de la molécula que se use como marcador, vamos a diferenciar los enzimoinmunoensayos, inmunocromatografías, fluoroinmunoensayos y los radioinmunoensayos.

Enzimoinmunoensayos: El marcador es una enzima

Enzimoinmunoensayos -> El marcador es una enzima. Por lo general se utilizan enzimas que inducen cambios de coloración en el sustrato, por lo que se detecta facilmente por colorimetria.

Sustrato Sitio activo Enzima La enzima une al sustrato La enzima libera los productos

Tipos de marcadores en inmunoensayos

1. Las técnicas basadas en Ag-Ac primarias. 1.1 Los marcadores

Inmunocromatografías: Nanopartículas coloreadas

> Inmunocromatografías > El marcador se realiza con nanopartículas coloreadas, generalmente de metales pesados.

Fluoroinmunoensayos: Sustancias fluorescentes

Fluoroinmunoensayos > Utilizan la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir fluorescencia cuando son excitadas con energía radiante. Los marcadores se denominan fluorocromo

Radioinmunoensayo: Isótopos radioactivos

Radioinmunoensayo -> El marcador es un isotopo radioactivo. Presentan inconvenientes debido a que los isótopos utilizados son peligrosos y obligan a disponer de instalaciones adecuadas para su uso.

COVID-19 : - + COVID-19 T T C T NONUN | | N MENNOTICIS BE Col. 191915 | | S PNEUMONIAE AS Fluorophore Antibody Antigen

Clasificación de los inmunoensayos

1. Las técnicas basadas en Ag-Ac primarias. 1.2 Clasificación de los inmunoensayos Además de la clasificación dependiendo del tipo de marcador, se agrupan los inmunoensayos dependiendo de si se establece competencia o no, o si es necesario retirar o no las moléculas que no han formado inmunocomplejos.

Inmunoensayos competitivos

Competitivos y no competitivos: Según se establezca o no competencia en la formación de inmunocomplejos. Competitivos: Para determinar un Ag en una muestra problema, se añade el anticuerpo correspondiente, y una cantidad determinada del mismo Ag marcado (Patron). El Ag marcado y el Ag de la muestra problema competiran por unirse a los Ac. Después se mide la cantidad de Ag marcado que se ha conjugado (inmunocomplejo), que será inversamente proporcional a la cantidad de Ag presente en la muestra.

Cuanto más Ag haya en la muestra, menos antígeno marcado formará inmunocomplejo.

Ab YY Ag* Ag Ag *- Ab + Ag-Ab Target protein - Enzyme-labeled antigen - Enzyme reaction - Antibody + * + Substrate Antibody Reagent Labeled Analyte Reagent Analyte in Specimen Antibody-Analyte Complex Bound label- Concentration of antigen ->

Inmunoensayos no competitivos

1. Las técnicas basadas en Ag-Ac primarias. 1.2 Clasificación de los inmunoensayos · Competitivos y no competitivos: Según se establezca o no competencia en la formación de inmunocomplejos. No competitivos: Para determinar un Ag en una muestra problema, se añade un anticuerpo marcado. Cuanto mayor sea la cantidad de Ag presente, mas Ac se unirán a el. Por tanto, la cantidad de Ac marcado que ha formado complejos es directamente proporcional a la concentración de Ag presente en la muestra.

Antibody - Antigen - Labeled second antibody Ab* Ag Ag-Ab* * + Labeled Antibody Reagent Analyte in Specimen Antibody-Analyte Complex Bound label -> Concentration of antigen

Inmunoensayos homogéneos y heterogéneos

1. Las técnicas basadas en Ag-Ac primarias. 1.2 Clasificación de los inmunoensayos Heterogéneos y homogéneos: Según la técnica, el resultado se puede medir directamente (Inmunoensayo homogéneo) o retirando del medio las moléculas que no se han conjugado (Inmunoensayo heterogéneo).

Inmunoensayos homogéneos

Homogéneas: Inmunoensayos que no requieren la separación de las moléculas sobrantes. Son fáciles y rápidas, sin necesidad de una fase sólida. Permiten detectar sustancias de bajo peso molecular y de concentración relativamente elevada, como pueden ser drogas.

Inmunoensayos heterogéneos

Heterogéneos: Requieren la separación de los inmunocomplejos y las moléculas no conjugadas. Suelen ser técnicas que utilizan un reactivo de fase sólida al cual se fijan los complejos, donde la separación de las moléculas no conjugadas se realiza mediante lavados.

Estas técnicas permiten detectar sustancias de alto peso molecular.

Reactivo de anticuerpo de fase sólida (Ac) Tubo de reacción Cuantificación del Complejo Ag-Ac* + Técnica Homogénea Muestra Ag + Reactivo de anticuerpo Marcado (Ac*) Técnica Heterogénea o Aislar y lavar el Complejo Ac-Ag-Ac*

Enzimoinmunoensayos

2. Enzimoinmunoensayos 2. Enzimoinmunoensayos Son inmunoensayos que utilizan enzimas como marcadores.

Sustrato + Centro activo a b C a b c Complejo ES Enzima

Inmunoensayos enzimáticos multiplicados (EMIT)

Inmunoensayos enzimáticos multiplicados (EMIT) Homogéneos competitivos

Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)

Análisis de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA) Heterogéneos no competitivos ELISA directo para la detección de antígenos ELISA indirecto para detección de anticuerpos ELISA sándwich DAS para detección de antígenos ELISA sándwich HADAS para detección de antígenos Heterogéneos competitivos ELISA de competición para detección de anticuerpos ELISA de competición para detección de antígenos ELISA de inhibición para detección de anticuerpos ELISA de inhibición para detección de antígenos

Inmunoensayos enzimáticos multiplicados (EMIT)

2. Enzimoinmunoensayos 2. Inmunoensayos enzimáticos multiplicados (EMIT, Enzyme-Mediated Immunoassay Techniquen) Utilizan una enzima conjugada con el analito de interés como marcador en una reacción enzima sustrato. Se basan en que se pueda determinar la cantidad de interacción entre el analito y el Ac o el Ag complementario utilizando un marcador enzimático. Se emplea comúnmente para la determinación de droga y ciertas proteínas en suero y orina, por lo que el analito que se quiere estudiar es por norma general un Ag.

Mecanismo de actividad enzimática en EMIT

Mecanismo de la actividad de una enzyma + Ag + Señal Curva dosis-respuesta Muestra Ag Enzima Activa con antígeno ligado Reactivo de anticuerpos Concentración Ag-Ac Centro catalítico libre Sustrato El Ag de la muestra compite con el Ag ligado a la enzima Enzyma Complejo Enzyma-substrato Enzyma Ag Ag Ag Actividad enzimática Señal Centro catalítico inaccesible Enzima Inactiva por complejo Ag-Ac

Funcionamiento de EMIT

2. Enzimoinmunoensayos 2.1 Inmunoensayos enzimáticos multiplicados La reacción inmunológica tiene lugar en medio líquido (Homogéneo) y se basa en una reacción de enlace competitivo entre el Ag de la muestra y el Ag marcado con una enzima.

v Cuando el Ag marcado forma un inmunocomplejo, la enzima que lleva unida se inactiva debido a un cambio en la conformación de la proteína Cuando el Ag marcado no se combina, la enzima se mantiene activa y reacciona con el sustrato generando un producto coloreado.

Si en la muestra hay poca cantidad de analito, muchos Ag marcados podrán formar inmunocomplejos (Ag-Ac) por lo que se inactivara la enzima.

Si en la muestra hay mucha cantidad del analito de interés, pocos Ag marcados formarán inmunocomplejos, por lo que la enzima se quedará activa y se formara mayor producto coloreado.

SIEMPRE POSITIVO PASSA MASSA NUNCA NEGATIVO memegenerator.es + Ag + Señal Gráfica al revés Curva dosis-respuesta Muestra Ag Enzima Activa con antígeno ligado Reactivo de anticuerpos Concentración Ag-Ac Centro catalítico libre Sustrato El Ag de la muestra compite con el Ag ligado a la enzima Ag Ag Ag Actividad enzimática Señal Centro catalítico Enzima Inactiva por inaccesible complejo Ag-Ac

Procedimiento básico de EMIT

2. Enzimoinmunoensayos 2.1 Inmunoensayos enzimáticos multiplicados

> Procedimiento básico de los EMIT.

1. Mezclar una muestra sospechosa de contener la sustancia de interés (Ag) con una solución que contiene una concentración conocida de Ac y el sustrato de la enzima
2. Dejarlo el tiempo que corresponda para que se formen los inmunocomplejos
3. Añadir el Ag marcado con la enzima en una concentración conocida
4. Medir la velocidad de aparición de color
5. Determinar la concentración de Ag problema mediante la comparación de la tasa observada con las tasas producidas por concentraciones conocidas de Ag patrón.

+ Ag + Muestra Ag Enzima Activa con antígeno ligado Reactivo de anticuerpos Concentración Ag-Ac Centro catalítico libre Sustrato El Ag de la muestra compite con el Ag ligado a la enzima Ag Ag Ag Actividad enzimática Señal Centro catalítico Enzima Inactiva por inaccesible complejo Ag-Ac alan alamy Señal Curva dosis-respuesta

Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)

2. Enzimoinmunoensayos 2.2 Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

> Las técnicas ELISA utilizan Ag o Ac conjugados con una enzima, de forma que, además de mantener su actividad inmunológica, tengan actividad enzimática.

El uso de enzimas como marcadores ha reemplazado a otros métodos que utilizaban marcadores como los fluorocromos o los isótopos radioactivos.

Características generales de ELISA

V CARACTERÍSTICAS GENERALES Uno de los componentes de la reacción está marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (Técnica heterogénea). De esta forma la reacción Ag-Ac queda inmovilizada en el soporte y puede ser fácilmente revelada mediante la adición de un sustrato específico que producirá color al reaccionar con la enzima.