Procesamiento Citológico y Tisular: Aplicación de Técnicas de Tinción

PROCESAMIENTO CITOLÓGICO Y TISULAR

APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE TINCIÓN

ÍNDICE

• FUNDAMENTOS GENERALES DE COLORACIÓN
• TIPOS DE COLORANTES
• MECANISMOS GENERALES DE COLORACIÓN
• COLORACIONES HISTOLÓGICAS DE CONJUNTO
• TÉCNICAS DE COLORACIÓN NO HISTOQUÍMICAS

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Registro y conservación de las muestras

Descripción macroscópica

Tallado de las muestras

Fijación tisular

Inclusión

Corte

TINCIÓN

Producción de artefactos

FUNDAMENTOS GENERALES DE LA COLORACIÓN

Los tejidos de origen animal son incoloros, salvo que contengan algún pigmento

COLORACIÓN

Los tejidos tienen la capacidad de incorporar y fijar de forma variable diversos colorantes

FUNDAMENTOS GENERALES DE LA COLORACIÓN

Los colorantes suelen ser hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas moléculas por afinidades químicas. Presentan 3 componentes:

• Esqueleto incoloro > Sustancias como el benceno, naftalina y antraceno
• Cromógeno > Componente que aporta el color
• Cromoforos > La organización molecular dentro del cromogeno responsable de la absorción de luz visible y que se excita para emitir colores
• Auxocromo > Ayuda al colorante a unirse a las estructuras que se van a colorear intensificando el color

CROMÓFOROS

3NO2

AUXOCROMO

-NO: + OH = wo NO, ON 02 Nº

BENCENO SUSTANCIA INCOLORA

TRINITROBENCENO CROMÓGENO

AC. PICRICO COLORANTE

TIPOS DE COLORANTES

• Según su origen:
  • Colorantes naturales -> se encuentran en la naturaleza: hematoxilina, carmín, safranina, orceína
• Colorantes artificiales > derivados de la anilina, eosina, azul de metileno
• Según el color que otorga a la muestra:
  • Ortocromáticos > tiñe de su mismo color: azul alcián, azul tripan
  • Metacromáticos > tiñe de otro color: naranja de acridina, azul de toluidina, orceína
• Según la naturaleza química del grupo auxocromo:
  • Básicos > son sales cuya base aporta el color y la parte acida es incolora. Tienen afinidad por sustancias ácidas del tejidos, como el ADN en el núcleo y el ARN: azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina
  • Ácidos > son sales cuya base es incolora y la parte ácida aporta color. Tienen afinidad por las bases como las estructuras proteicas del citoplasma: fucsina ácida, eosina
  • Neutros > aportan color la porción ácida y la básica: eosinato de azul de metileno
  • Indiferentes > se disuelven en los tejidos en lugar de unirse químicamente a ellos: sudan black, rojo escarlata

TIPOS DE COLORANTES

• Según la naturaleza química del grupo cromoforo:
  • Nitrosos -> Ácido piruvico, 2,4,6-trinitrotenol
  • Azoicos > Naranja disperso 1, naranja de metilo, cromotropo 2R, azul tripán, rojo Congo, Sudán negro y rojo
  • Derivados de la antraquinona > Alizaridina S
  • Derivados de la acridina > Narania de acridina
  • Derivados del difenilmetano -> Fucsinas, fast green y trifenilmentano
  • Derivados de xanteno - à Pironina, rodamina
  • Derivados de ftalocianinas -> Azul alcián
  • Derivados de iminas quinónicas > Azul de Nilo, azul de metileno, azul de toluidina, violeta de cresilo
• Según su uso:
  • Tinciones de rutina > HEMATOXILINA Y EOSINA
  • Tinciones especiales > Azul alcián, mucicarmina, PAS, Fontana-Masson, tricromicos

MECANISMOS GENERALES DE COLORACIÓN

La visibilidad, especificidad y selectividad del método de coloración se ve afectado por varios factores:

• Grosor de la preparación > Cuanto mas fina la sección, mayor capacidad de difusión tendrá el colorante
• Concentración de moléculas de estudio presentes en la muestra > Cuanto mayor sea la presencia de moléculas con afinidad por el colorante, mayor cantidad de colorante podrá acumularse

La afinidad del colorante por una estructura también es un factor clave en el resultado de coloración:

• Afinidad por fuerzas electrosestáticas > resultan en la acumulación de colorantes ionizados en regiones del tejido con iones de carga opuesta
• Fuerzas intermoleculares como puentes de hidrógeno, fuerzas de van Wals o interacciones hidrofóbicas > propiciadas por el disolvente y que retendrían el colorante en el lugar al contactar con moléculas del espécimen
• Fuerzas covalentes -> establecidas entre el colorante y el tejido.

MECANISMOS GENERALES DE COLORACIÓN

Existen tres mecanismos generales de coloración:

• Físicos -> Está ligado a las propiedades de disolución (solubilidad) e impregnación (adsorción) del colorante sobre el tejido. El colorante se absorbe y por ello se tine el tejido del color del colorante
• Histoquímicos > se basa en la reacción química que tiene lugar entre el colorante y la estructura dentro del tejido objeto de tinción. De esta forma, se constituye un nuevo cromógeno responsable del color adquirido
• Fisicoquímico > fisicoquímico se llevaría a cabo bien por fuerzas de tensión superficial que permitirían la interacción molecular en la fase líquida o bien por fuerzas de atracción electrostática (por ejemplo, las cargas eléctricas de un colorante aniónico le harían unirse a los cationes de una proteína tisular)

a b C 3

Figura 5.1 Mecanism a) Físico;

COLORACIONES HISTOLÓGICAS DE CONJUNTO

• Algunas técnicas de coloración tiñen el conjunto del tejido:
  • Hematoxilina-eosina
  • Soluciones de azur-eosina-azul de metileno según Giemsa
  • Azul celestina B
  • Colorante plasmático cromotropo 2R
• HEMATOXILINA-EOSINA -> técnica utilizada rutinariamente en el laboratorio de anatomía patológica, gran poder de resolución, económica y fácil de realizar . Para cualquier coloración histológica de conjunto es necesario PREPARACIÓN PREVIA DEL TEJIDO

COLORACIONES HISTOLÓGICAS DE CONJUNTO: PREPARACIÓN DEL TEJIDO

• Fijación:
  • La fijación de los tejidos mejora los resultados en las coloraciones histológicas
  • Se puede utilizar cualquier fijador (formol, líquido de Bouin ... ) excepto el tetraóxido de osmio
• Desparafinación y rehidratación:
  • La parafina y el agua son inmiscibles y muchos colorantes son hidrosolubles
  • Para que los colorantes puedan penetrar en los tejidos hay que seguir el siguiente procedimiento:
    • Introducir los portaobjetos en la estufa a 60℃ durante 2-3 min > Ablandar la parafina y conseguir una mayor adhesión
    • Las muestras se pasan por una batería de cubetas de desparafinación - 3x xilol > 2x 100% etanol > 2x 96% etanol > 2x 70% etanol (opcional)
    • Últimos baños en agua para rehidratar (x2)
    • Se suele realizar dentro de la campana para evitar los vapores del xilol y el etanol

COLORACIONES HISTOLÓGICAS DE CONJUNTO: PREPARACIÓN DEL TEJIDO

BATERÍA DE DESPARAFINACIÓN-HIDRATACIÓN

Láminas portaobjetos

Batería de desparafinación- hidratación

Cestillo de tinción

2x (Agua grifo, 2min)

2x (Etanol 96 %, 2min)

1

Batería de deshidratación

2x (Etanol 100 %, 2min)

3x (Xilol, 2min)

Cubeta de tinción

CAMPANA DE LABORATORIO

COLORACIONES HISTOLÓGICAS DE CONJUNTO: FUNDAMENTOS HEMATOXILINA-EOSINA

HEMATOXILINA

• Colorante natural de carácter básico y con carga eléctrica positiva (catiónico)
• La hematoxilina se oxida de forma espontánea convirtiéndose en HEMATEINA > Agente colorante activo
• En el proceso de tinción se suele utilizar el yodato de sodio (NalO3) para la oxidación
• La solución debe preservarse en recipientes opacos a fin de aumentar su estabilidad y evitar la continua oxidación
• La afinidad de la hemateína por los tejidos es pobre > Uso de un mordiente de sales metálicas (aluminio o hierro) > Solución conjunta HEMALUMBRE
• Hemalumbre -> colorante catiónico o basófilo catiónico, se unirá a los ácidos nucleicos de los núcleos celulares y los tenirá de azul

COLORACIONES HISTOLÓGICAS DE CONJUNTO: FUNDAMENTOS HEMATOXILINA-EOSINA

HEMATOXILINA

YODATO DE SODIO

HEMATEÍNA

YODURO DE SODIO

OH 0 H OH HO H H2 H + Nal + 3 H2O H H H OH TI Ö OH HO OH 0 0 OH

Grupos hidroxilo carbonilo adyacentes en la hemateina

OH 0 OH Al OH

HEMALUMBRE

OH O H2 OH OH H H, H H H + NalO3 H H OH OH y

COLORACIONES HISTOLÓGICAS DE CONJUNTO: FUNDAMENTOS HEMATOXILINA-EOSINA

TIPOS DE HEMATOXILINA

• Hematoxilina de Mayer:
  • Procedimiento progresivo -> La intensificación del color azul se logra al dejar más tiempo la muestra en la solución > Solo tiñe los núcleos
• Hematoxilina de Harris:
  • Procedimiento regresivo > Tiñe todas las estructuras tisulares, pero se va decolorando con los lavados hasta dejar tenidos únicamente los núcleos

Solución matriz de hematoxilina de Mayer

Solución matriz de hematoxilina de Harris

Alumbre de amonio o de potasio 50,0 g

Hematoxilina 5,0 g

Agua destilada 1000,0 mL

Etanol al 100 % 50,0 mL

Cristales de hematoxilina 1,0 g

Alumbre de potasio o de amonio 100,0 g

Yodato de sodio 0,2 g

Agua destilada 1 000,0 mL

Ácido cítrico 1,0 g

Óxido rojo de mercurio 2,5 g

Hidrato de cloral 50,0 g

COLORACIONES HISTOLÓGICAS DE CONJUNTO: FUNDAMENTOS HEMATOXILINA-EOSINA

EOSINA

• Colorante de carácter ácido y con carga eléctrica negativa (aniónico)
• Presenta afinidad por las proteínas cargadas positivamente que integran el citoplasma > color en diversos tonos de rosa

COO- Br Br Br Br

COLORACIONES HISTOLÓGICAS DE CONJUNTO: HEMATOXILINA-EOSINA DE MAYER

PREPARACIÓN DE LA HEMATOXILINA DE MAYER

Se mezcla la mitad de agua destilada con hematoxilina y se calienta

Al hervir se añade el resto del agua, el yoduro de sodio y el alumbre

Se mezcla todo hasta que quede bien disuelto. No es necesaria su maduración ni su filtrado antes de usar.

COLORACIONES HISTOLÓGICAS DE CONJUNTO: HEMATOXILINA-EOSINA DE MAYER

PROCEDIMIENTO: Tinción progresiva

Hematoxilina de Mayer 10-15 min

Agua grifo 10 min

H2O destilada 1-2 min

Etanol 80% 1-2 min

Eosina- floxina 2 min

Agua grifo 2 min

Agua grifo 2 min

Etanol 96% 2 min

2

Hematoxilina-eosina de Mayer

Xilol 2 min

Xilol 2 min

Xilol 2 min

Etanol 100% 2 min

Etanol 100% 2 min

Etanol 96% 2 min

9

COLORACIONES HISTOLÓGICAS DE CONJUNTO: HEMATOXILINA-EOSINA DE MAYER

RESULTADOS

• Los núcleos se tiñe de tono azulado por acción de la hematoxilina que al ser un colorante catiónico (básico), presentará afinidad por estructuras ácidas > Ácido nucleicos
• El citoplasma y la mayoría del resto de tejidos se tiñen de rosa por acción de la eosina que al ser un colorante aniónico (ácido) que presenta afinidad por estructuras básicas -> Aminoácidos básicos presentes en proteínas