Aplicacion de Tecnicas de Extraccion de Acidos Nucleicos, Es Moratalaz

PROPIEDADES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

PROPIEDADES DEL DNA

1. CARÁCTER ÁCIDO

El ADN se encuentra casi siempre neutralizado fisiológicamente por interacción iónica con las cargas positivas de iones como el Ca2+ o el Mg2+, y también con los grupos positivos de las proteínas básicas, como las histonas. En cada unión fosfodiéster aparece la carga negativa de los grupos fosfato; por tanto, el ADN es un POLIANIÓN. Fosfato 5'CH2 Base .0 3 0 0 Unión Fosfodiester 0 0 = Base 5 CH 2 0 1 3 0 ) -0 0 0 BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

2. ALTA ESTABILIDAD

Dicha estabilidad se la proporcionan dos tipos de enlaces: ALCALIT · Puentes de hidrógeno: Se establecen enlaces ecnorifirecontre bases ACICLO complementarias (2 entre A=T y 3 entre C=G). 9 |10|11 |12 13 14 La máxima estabilidad del ADN se encuentra en el intervalo de pH comprendido entre 4 y 7. Fuera de estos límites, la doble hélice se hace inestable. Los ADNs más estables serán los ricos en C y G. No obstante, el ADN humano es más rico en A y T, por lo que resulta más inestable de lo que pudiera ser. · Interacciones hidrofóbicas: (o de apilamiento) Estas interacciones son inespecíficas (independientes del tipo de base implicada), y se establecen entre bases apiladas de una misma cadena, como consecuencia de la proximidad y paralelismo de sus anillos aromáticos hidrofóbicos. El interior de la doble hélice, altamente hidrofóbico, queda aislado del medio acuoso. Las interacciones de la doble hélice son cooperativas, lo que significa que la separación de las hebras en un punto favorece que se sigan separando en el resto de la molécula, hecho que queda evidenciado en la desnaturalización. BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

-PIRIMIDÍNICAS NH. N. C Pirimidina H Citosina Timina (exclusiva del ADN) Uracilo (exclusiva del ARN) PÚRICAS NH. - I CTH H Purina H Adenina Guanina TIMINA o=P CH2 13 H 0 0=P CH2 .0. H H N N-H --- H H H H 0 -Ň H N 0 H CH2 CITOSINA H H H N-H -~ GUANINA o=P-O" CH2 0 H H N ---- H-N H H H 0 ----. H-N N H 0 CH O=P-0 1 -C o=P-0" 0 BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

3. SOLUBILIDAD

Debido a su carácter polar, el ADN es soluble en agua e insoluble en los disolventes orgánicos.

4. VISCOSIDAD

Al ser el ADN una molécula relativamente rígida (en doble hélice), muy alargada y de alto peso molecular, las disoluciones de ADN son muy viscosas. Para poder trabajar con DNA habrá que hacerlo en disoluciones bajas. Si el ADN se pliega, su viscosidad disminuye.

5. DENSIDAD

La densidad de ADN es de 1,7 g/cm3, y es menor que la del ARN. Depende del contenido en guanina y citosina; a mayor cantidad de GC, mayor densidad del ADN debido a los tres puentes de hidrógeno, a diferencia de lo que sucede con la unión de TA. BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

Ha C H H H H -0- 0=P-0 -O-0-O- H H H N -0 H H ADENINA H H CH, H

6. ABSORBANCIA A 260 NM

» Para que los AN mantengan su funcionalidad en las técnicas de BM, se requiere un determinado grado de pureza, reduciendo al mínimo los contaminantes (proteínas, polisacáridos, sales, reactivos usados en la extracción y purificación). » La pureza de un AN es el parámetro que determina la ausencia de posibles contaminantes. » La medida del grado de pureza se basa en una de las propiedades de los AN: su máxima absorbancia a una longitud de onda de 260 nm. BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

El ADN absorbe luz ultravioleta con un máximo a 260 nm, debido al carácter aromático de sus bases nitrogenadas, puesto que estas son cromóforos. Rayos X Ultravioletas Luz Visible Rayos Infrarojos Rayos Ultravioleteta Extremos UV - C UV-B UV -A 10 200 280 315 400 700 Luz De Mercurio de Baja Presion (254 nm) Sin actividad El ADN, el ARN, los oligonucleótidos e incluso los mononucleótidos pueden cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia de luz ultravioleta de esa solución a 260nm. BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

El ADN absorbe más a esta longitud de onda cuando está desnaturalizado; es decir, en forma de cadena simple, que formando parte de la estructura de doble hélice, puesto que la propia estructura interfiere con la absorción. A 1.2- SSDNA 1.0 90℃ Absorbance 0.8- 0.6- 0.4 30°℃ 0,2 dsDNA 0.0 220 240 260 280 300 320 340 360 nm BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

Esta característica permite observar un efecto hipercrómico, cuando el ADN se está desnaturalizando, mientras que aparece un efecto hipocrómico, cuando se encuentre en forma de doble hélice, lo que nos permite determinar el grado de desnaturalización de un determinado ADN. El ADN presenta menor absorbancia que el ARN. De inaturali za ción Calor Doble hélice Doi. hällcet conciliar Nucleoidot libre: EFECTO HIPERCRÔMICO 65 75 85 95 Temperature (°℃) Aumento de la abiorbancia a 2.600 Am strong "BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

SS DNA 1.4 Relative Absorbance (OD260 ) 1.3 1.2 1.1 ds DNA Tm = 85°℃ 1.0 -

Podemos comprobar la pureza de una solución de ácidos nucleicos, mediante espectrofotometría, y se suele medir el grado de contaminación mediante la ratio siguiente: A260nm/A280nm Este ratio es diferente, dependiendo de si las soluciones son de ADN o de ARN. . Solución pura de ADN: 1.7-2 · Solución pura de ARN: 1.9-2.1 · Solución pura de proteína: 0.6 100% DNA 60% DNA40% Protein 40% DNA/60% Protein 3 - 20% DNA/90% Protein 14% DNA/86% Protein 10% DNA/90% Protein 6.5% DNA/93.5% Protein 2- 2% DNA/96% Protein 100% Protein 1- 0- 220 240 260 280 300 Wavelength (nm)

Esta ratio (A260nm/A280nm), también es muy sensible a la contaminación por fenol (que puede haber sido utilizado en la extracción del ADN), por lo que en estas técnicas hay que ser muy riguroso con el método empleado. - 0 % Phenol (v/v) - 0.2% Phenol (v/v) 0.3 % Phenol (v/v) 0.4 % Phenol (v/v) 3- - 0.5 % Phenol (v/v) 1.0 % Phenol (v/v) 2 0.2 1.7 41 0.3 1.7 59 0.4 1.6 68 1 0.5 1.6 74 1.0 1.3 82 0+ 220 240 260 280 300 Wavelength (nm) BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

[Phenol] A260/280 Calc'd [DNA] (% accuracy) 0.0 1.9 0 Absorbance 4% DNA/96% Protein Absorbance 30% DNA/70% Protein El espectro es diferente si hay contaminación con proteínas, porque estas presentan un máximo de absorbancia a 280 nm. Cuanto mayor sea la concentración de proteínas, menor es la absorbancia a 260. BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

· En el ADN » Valores de A260/A280 de 1,6 e inferiores indican contaminación excesiva de la muestra por proteínas o fenoles. La contaminación por proteínas se puede solucionar mediante un tratamiento con proteinasa K. › Si la contaminación es por fenoles (habitual cuando se ha utilizado un método de purificación basado en solventes orgánicos) hay que repetir el proceso de purificación con cloroformo/alcohol isoamílico y posterior precipitación del ADN con isopropanol o etanol. » Valores de A260/A280 superiores a 2,0 indican una concentración elevada de ARN, ya que la A de ARN a 260 nm es mayor que la del ADN. La contaminación por ARN se puede eliminar mediante tratamiento con ARNasas. BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

A260nm/A230nm " Esta ratio, para soluciones puras de ácidos nucleicos está entre 2,0-2,2. Si la proporción es sensiblemente inferior a lo que se espera, puede ser debido a la presencia de contaminantes que absorben a 230 nm, como EDTA, carbohidratos, fenol o urea, en la solución donde estamos analizando el ADN. En este caso sería conveniente precipitar y lavar de nuevo el AN con etanol, dejarlo secar y resuspenderlo de nuevo. . Este cociente no es tan específico como el anterior. Puede emplearse también la absorbancia a 325 nm para poner de manifiesto la presencia de restos en la solución o la suciedad de la cubeta, en general, la turbidez de la solución. Aunque no es imprescindible, este valor se debería restar de las medidas a 260 nm, 280 nm y 230 nm antes de calcular los correspondientes cocientes. BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

» Las medidas de absorbancia se suelen realizar en muestras diluidas en agua destilada o tampón TE (Tris or tris(hidroximetil)aminometano más EDTA) » Antes de realizar las medidas, se ajusta el cero de absorbancia en el espectrofotómetro con el diluyente empleado. BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

7. DESNATURALIZACIÓN

Es la rotura de la doble hélice del ADN para dar lugar a dos cadenas sencillas. El DNA se desnaturaliza principalmente por efecto de agentes físicos (calor) o químicos (ácidos, bases, detergentes ... ), debido a la ruptura de los puentes de hidrógeno entre pares de bases y de las interacciones hidrofóbicas entre bases apiladas. No se suelen utilizar condiciones ácidas (pH por debajo de 4) para desnaturalizar el ADN, porque conlleva el riesgo de que se desnaturalice definitivamente. · Al desnaturalizarse el ADN se hace menos viscoso y absorbe más a 260 nm, lo que nos permite valorar el grado de desnaturalización que ha alcanzado un determinado ADN tras ser sometido a una técnica concreta. BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

Cambios en la viscosidad y absorción óptica del DNA por efecto de la temperatura (resultados similares se obtienen con cualquier otro agente desnaturalizante) A mayor temperatura, mayor grado de desnaturalización Temperatura ("C) Ter peratura ('C) mens pt o concentración de agente desnaturaitzante) (similarmente OH o concentración en desnaturs zzante) Descenso de la viscosidad Aumento de la absorción optica BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

Cuanto mayor es la fracción molar de pares de bases C-G que posea el ADN en cuestión, tanto más elevada es la temperatura o el pH que necesitamos para que se realice la desnaturalización/fusión. # Se denomina temperatura media de fusión, Tm (de "melting", fusión) a aquella a la que ha desnaturalizado el 50% de la doble cadena. · Si se degradan las hebras en nucleótidos libres aumenta más la absorción (efecto hipercrómico). efecto hipercrómico por desnaturalización del DNA Strand separation Denatured single strands Relative light absorbence at 260 nm 1.40 1.30 Further denaturation 1.20 Malting temperature Denaturation begins 1.10 Double stranded DNA 1.00 30 50 70 7. 90 100 110 Temperature, *C. 1,4 UV - absorption 1,2- double helix random coil single stranded DNA 1.0- Tm 30 50 70 90 110 temperature [ °℃ ] 90

UNIDAD 4: APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Epígrafe 4.3. PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

A A C G A T G BIOLOGÍA MOLECULAR ES Moratalaz

ÍNDICE DEL TEMA

PROPIEDADES DEL DNA

1. CARÁCTER ÁCIDO.
2. ALTA ESTABILIDAD
3. SOLUBILIDAD
4. VISCOSIDAD
5. ABSORBANCIA A 260 NM
6. DESNATURALIZACIÓN
7. RENATURALIZACIÓN
8. HIBRIDACIÓN

PROPIEDADES DEL RNA

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