Guía práctica de química clínica sobre fosfatasa alcalina y ácida

UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA

FACULTAD DE MEDICINA ALBERTO HURTADO

PREGRADO EN TECNOLOGÍA MÉDICA

GUÍA PRACTICA Nº 5 QUIMICA CLINICA GENERAL FOSFATASA ALCALINA FOSFATASA ACIDA TOTAL Y PROSTATICA 2025 - I LIMA-PERU

COMPETENCIAS

Al culminar la práctica de determinación de Fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida total y prostática, el estudiante presentará las siguientes competencias:

1. Conoce la importancia de la determinación de la Fosfatasa alcalina y la Fosfatasa ácida total y prostática
2. Conoce y describe los diferentes métodos para cuantificar la fosfatasa alcalina y la fosfatasa ácida total y protática.
3. Conoce y aplica los cálculos para determinar las concentraciones de la fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida total y protática.
4. Conoce los intervalos de referencia para la fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida total y protática.
5. Interpreta y analiza los resultados obtenidos en la determinación de la fosfatasa alcalina y/o fosfatasa ácida.
6. Conoce las causas que conllevan a un incremento en la concentración de ambas fosfatasas.
7. Conoce los factores preanalíticos, analíticos y post-analíticos que afectan las concentraciones de estos parámetros bioquímicos.

FOSFATASAS ALCALINAS

La actividad de la fosfatasa alcalina (FA) está presente en varios tejidos, que incluyen hígado (se localiza en la membrana celular que une el borde senoidal de las células del parénquima a los canalículos biliares), hueso, riñón, bazo, intestino y placenta. La fosfatasa alcalina en suero está presente en isoenzimas no fijadas o en complejos con lipoproteínas o, más raramente, inmunoglobulinas. Su papel exacto difiere de un lugar a otro, y en el hígado su papel no está claro. La fosfatasa alcalina intestinal y placentaria es antigenicamente distinta de la FA del hígado, hueso y riñón. La mayor parte de la FA en suero, en los pacientes normales, está constituida por FA hepática y ósea.

Las FA son un grupo de isoenzimas que tienen en común la capacidad de hidrolizar los enlaces éster de los fosfatos orgánicos en un medio alcalino, reacción por la que se genera un radical orgánico y un fosfato inorgánico.

La actividad óptima de estas enzimas se ejerce a pH aproximadamente igual a 15, requiere iones magnesio y Zinc para su estabilidad y actividad máxima, es inhibida por el calcio y el fosfato inorgánico.

Las isoenzimas de la FA que proceden de los diversos tejidos son muy distintas, presentan diferencias en lo que respecta a carga neta, inhibición frente a urea y a fenilalanina y estabilidad al calor.

MUESTRA

• Las muestras de sangre deben ser extraídas luego de un ayuno de por lo menos ocho (8) horas
• El suero y el plasma heparinizado dan resultados similares.
• Otros anticoagulantes como EDTA, oxalato y citrato inhiben la enzima al complejar el magnesio y no deben ser usados.
• Una hemólisis leve puede ser tolerada, pero se debe evitar la hemólisis visible.
• La bilirrubina no interfiere con los métodos cinéticos cuando se emplea p- nitrofenil fosfato como sustrato.
• Investigadores señalan que la actividad de la fosfatasa alcalina aumenta lentamente cuando se conserva a temperatura ambiente o en el refrigerador.
• Como regla general, es conveniente analizar las muestras para fosfatasa alcalina el mismo día que son extraídas.

METODOS DE ANÁLISIS

Método Tipo de Análisis Principio Uso Comentario

Shinowara y col. Espectrofotométrico de -Sustrato: - glicerofosfato. Todos los líquidos del organismo; dos puntos manual. Mide la liberación del fosfato inorgánico: 1 h de incubación Período de incubación largo; fosfato basal elevado en las muestras

King y Armstrong Espectrofotométrico de -Sustrato: fenilfosfato punto final Todos los líquidos Mide la liberación de fenol del organismo; con el reactivo de Folin manual Ciocalteu; 30 min. de incubación Requiere la desproteinización de la muestra

Kind y King Espectrofotométrico de -Sustrato: Fenilfosfato punto final Mide la liberación de fenol del organismo; con 4-amino- antipirina manual / automatizado como reactivo cromógeno; 15 min. de incubación Todos los líquidos Más rápida que la de King y Armstrong No requiere desproteinización

Bessey y col. Espectrofotométrico de -Sustrato: p- punto final o cinético nitrofenilfosfato -Mide la formación del ion manual / p-nitrofenóxido amarillo automatizado

Moss Espectrofotométrico de punto final o cinético -Sustrato: a-naftol monofosfato -Mide la formación de anaftol a 340 nm Todos los líquidos del organismo; manual/ automatizado Rápido; conviene medir a 340 nm

Cornish y col. Fluorescente -Sustrato. 4- metillumberifenil fosfato Todos los líquidos del organismo, automatizado Muy sensible

Bowers y Mc Comb Espectrofotométrico cinético o de punto final -Sustrato: pNPP -Mide liberación de p- nitrofenóxido en un buffer transfosforilado Manual o automatizado Propuesto como método de referencia; más sensible que el de Bessy y col. Todos los líquidos del organismo; Rápido: La absorbancia varía en forma lineal con el tiempo

INTERVALOS DE REFERENCIA

Los intervalos de referencia en suero para personas sanas, determinados a 30℃ por el método descrito, son:

Grupo Mujeres: (edad en años) FA (Hasta U/L) Grupo Varones: (edad en años) FA (hasta U/L)

Recién nacidos 250 Recién nacidos 250

1 a 12 350 1 a 12 350

10 a 14 280 10 a 14 275

15 a 19 150 15 a 19 155

20 a 24 85 20 a 24 90

25 a 34 85 25 a 34 95

35 a 44 95 35 a 44 105

45 a 54 100 45 a 54 120

55 a 64 110 55 a 64 135

65 a 74 145 65 a 74 140

75 + 165 75 + 190

Los factores que aumentan la actividad de FA en una población normal son: el ejercicio, períodos de rápido crecimiento óseo en los niños y embarazo.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA

• La actividad sérica de la FA alcanza su mayor actividad en los niños en edad de crecimiento (llegando a triplicar los niveles del adulto), debido a que esta isoenzima se localiza en los osteoblastos (relacionados con la calcificación y formación de estructuras óseas)
• Existe un aumento fisiológico que se produce al final del primer trimestre del embarazo, a expensa de la isoenzima placentaria que en este período alcanza niveles máximos (aproximadamente el doble de los valores normales).
• La FA se eleva rápidamente y sus valores pueden exceder diez veces del límite superior de lo normal, cuando el flujo de bilis está deteriorado o se desarrollan lesiones expansivas, aunque estas sean pequeñas, pero numerosas, como granulomas, o grandes y únicas, como una metástasis tumoral.
• Cuando el flujo de bilis se detiene, ya sea por una colestasis intrahepática u obstructivas, la FA se eleva hasta el doble del límite superior de lo normal o más, siguiendo de manera aproximadamente paralela, la tasa de elevación de la bilirrubina en suero.
• Si la obstrucción es parcial, la fosfatasa alcalina suele elevarse tanto como en la obstrucción completa, pero la bilirrubina no lo hace (Colestasis anicterica).
• La fosfatasa alcalina esta también moderadamente elevada en la mayoría de los casos de ictericia producida por lesión hepática, lo cual podría reflejar un componente menor de colestasis.
• Cuando la colestasis se resuelve, la FA cae hasta niveles normales, pero más lentamente que la bilirrubina.
• El aumento de la FA en las colestasis se debe a un aumento de la síntesis de la enzima por los hepatocitos, más que una reducción en la excreción biliar.
• Entre otras patologías que pueden afectar la actividad sérica de fosfatasa alcalina, se puede citar: Carcinomas metastásicos en hígado y en hueso (productores de enzima), Colestasis biliar, fenómenos osteoclásticos, trastornos de mala absorción acompañados de lesiones ulcerosas (donde la deficiencia de vitamina D produce osteomalacia con el consecuente aumento de fosfatasa alcalina ósea) e incluso en vías de reparación tales como: infarto agudo de miocardio, infarto pulmonar o renal.
• En un raquitismo congénito por herencia recesiva, la FA se encuentra muy disminuida o ausente totalmente.
• En el hipotiroidismo infantil, con o sin cretinismo, existe disminución de la FA.
• En el escorbuto, enfermedad celiaca, en la acondroplasia, existe disminución de la FA.

Criterio Clínico: El aumento de la FA tiene verdadero interés clínico en las ictericias, para confirmar su naturaleza obstructiva, y en las enfermedades óseas, especialmente en el diagnóstico de la enfermedad de Paget (osteítis deformante) y en el pronóstico del raquitismo y del carácter maligno de su neoplasia ósea. La colestasis disociada descubre hepatopatías anictéricas.

CAUSAS DE ERROR

• El uso de anticoagulantes como EDTA, fluoruros, oxalatos y citratos no deben emplearse ya que afectan la actividad de la enzima.
• El análisis debe realizarse tan pronto como sea posible, ya que la actividad de la FA se incrementa aproximadamente de 5 a 10% al reposar a temperatura ambiente o en el refrigerador por varias horas. Conservarse entre 2-8℃ si se va a procesar dentro de las primeras seis horas de obtenido el suero, si se requiere por mayor tiempo conservar a - 20℃.
• La dieta puede inducir un aumento de la actividad de ALP de individuos con grupo de sangre B y O que son secretores. Los valores pueden ser 25% más altos después de la ingesta de una comida rica en grasa.
• El uso de sueros hemolizados dará resultados erróneos, ya que la enzima se encuentra casi seis veces más dentro de los eritrocitos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Determinación de Fosfatasa alcalina

En la actividad práctica se realizará la determinación de esta enzima a través del Método cinético (IFCC) a 405 nm, para la determinación de fosfatasa alcalina (ALP 405 AA).

Fundamento

La fosfatasa alcalina (ALP o monoester ortofosfórico fosfohidrolasa, EC. 3.1.3.1.) hidroliza al p-nitrofenilfosfato (p-NFF), que es incoloro, produciendo fosfato y p-nitrofenol a PH alcalino. La velocidad de aparición del anión p- nitrofenolato (amarillo) a 405 nm, es proporcional a la actividad enzimática de la muestra.

Rvo premezclado: 1.0 ml Preincubar unos minutos 405 nm Muestra 20 uL A0 4 A0 A1 A 2 A°3 0 min. 20 seg. 1 min. 2 min. 3 min. 4 min. Resultados: expresados en U/L FAL (U/L) a 405 nm = AA/min x FACTOR

Recolección de muestra y estabilidad: Suero o plasma heparinizado libre de hemólisis. Emplear preferentemente fresco. De 2 a 8°C son estables durante 7 días.

Estabilidad de reactivos y conservación: fecha de vencimiento en Temperatura de 2 a 8°C. Reactivo único (premezclado): estable 5 semanas de 2 a 8℃ y 3 semanas a temperatura ambiente ( ≤25℃) a partir de la fecha de su preparación siempre que se mantenga protegido de la luz.

Tipo: Cinético Tiempo de reacción: 4 min. 20 seg. Longitud de onda: 405 nm Temperatura de reacción: 37℃ Volumen de muestra: 20 µL Disolución tampón (A): Tampón 2-Amino-2- metil-1-propanol, conteniendo sales de magnesio. Sustrato (B): solución conteniendo p- nitrofenilfosfato (p-NFF).

Indicaciones de alteración de los reactivos: Presencia de turbidez o de partículas. Blanco del reactivo de trabajo ≥ 1.500 Linealidad: 1200 U/L Limite de detección: 5 U/L

MÉTODO CINETICO

p-nitrofenilfosfato para la determinación de Fosfatasa alcalina