Repaso T2: Técnicas basadas en las reacciones antígeno-anticuerpo en Biología

TÉCNICAS BASADAS EN LAS REACCIONES AG - AC

Las técnicas secundarias

Las técnicas secundarias no valoran directamente los complejos inmunes sino que lo hacen de manera indirecta, atendiendo a los cambios físicos visibles que se producen en el medio.

Las uniones Ag - Ac pueden producir distintas reacciones, entre las que destacan dos que inducen cambios físicos visibles y forman el fundamento de muchas técnicas secundarias:

• Reacciones de aglutinación: cada anticuerpo puede unirse a varios antígenos y cada antígeno a varios anticuerpos, que como consecuencia se forma una red de antígenos y anticuerpos que provoca una aglutinación en el medio.
• Reacciones de precipitación: algunas uniones Ag - Ac son complejos demasiado grandes para mantenerse en disolución y precipitan en el medio.
  • Fijación del complemento: se usan los hematies como sistema revelador.

Técnicas de aglutinación: se basan en la capacidad que tienen los antígenos particulados multivalentes para unirse a sus anticuerpos complementarios dando lugar a inmunocomplejos o agregados visibles a simple vista.

Si tenemos en cuenta las diversas clases de anticuerpos, la IgM tiene mayor poder aglutinante ya que su estructura es paramétrica, es decir, tiene 10 puntos de unión al antígeno. Por esto es el más eficaz para entrecruzar epítopos.

• Antígenos multivalentes: son los que tienen varios epítopos o puntos de unión al anticuerpo.

Técnicas de aglutinación

• Aglutinación: ocurre cuando las concentraciones de antígenos y anticuerpos son equivalentes.

Si existe desequilibrio, por exceso de antígeno como de anticuerpos, se produce un fenómeno de zona, y el resultado es un falso negativo.

Dependiendo de que el antígeno sea particulado o haya necesidad de insolubilizarlo por fijación sobre un soporte, existen dos tipos de reacciones de aglutinación:

• Aglutinación directa: suspensión de bacterias, protozoos, esporas, hematíes y hemaglutinación directa.
• Aglutinacion indirecta: suspension de partículas con antígenos soluble absorbido, suspension de hematies sensibilizados con antigenos y hemaglutinación indirecta.

Técnicas de aglutinación directa

Estas técnicas se basan en detectar la reacción de aglutinación que provoca la formación de algunos inmunocomplejos.

Se usa una suspensión de antígenos formes o particulados (bacterias, protozoos, esporas) que en sus membranas o paredes celulares expresan los determinantes antigénicos. Cuando estasuspensión antigénica se enfrenta a un suero problema que contiene anticuerpos, se producirá la aglutinación por formación de los inmunocomplejos.

La lectura es inmediata ya que a simple vista se aprecia la formación de esos agregados insolubles. La forma de visualizarlos depende del soporte sobre el que se realice la reacción:

• Sobre un soporte plano (portaobjetos o tarjeta): la reacción positiva implica la formación de grumos.
• En una placa de microtitulación: el positivo se indica por la formación de un velo en la superficie. Si no hay aglutinación, los antígenos particulados sedimentan en el fondo de los pocillos en forma de botón.

Positive C Negative

Las técnicas de aglutinación pueden ser cualitativas o semicuantitativas si se hacen diluciones del suero y se determina el título.

Título: medida relativa de la actividad de los anticuerpos.

Las técnicas directas, tanto de aglutinación como de precipitación, se usan para identificar bacterias o tipificar eritrocitos, pero por su simplicidad y sensibilidad se empezaron a aplicar para la identificación de anticuerpos y diagnóstico de procesos infecciosos.

• Hemaglutinación directa: tipo especial de aglutinación directa y se aplica a la determinación de grupos sanguíneo del sistema ABO y Rh. Aunque se conocen más de 100 antígenos, no todos desencadenan reacciones de transfusión tan severas como los antígenos (ABO y Rh).
  • Antígenos ABO: los anticuerpos contras los antígenos ABO son isohematoglutininas y se descubren por una reacción de aglutinación con células de un tipo ABO conocido. En otras palabras, el suero que contiene anticuerpos contra antígenos ABO hace que se aglutinen los eritrocitos.

Hay cuatro fenotipos básicos:

• Tipo A: eritrocitos con Ag A.
• · Tipo B: eritrocitos con Ag B.

Tipo AB: eritrocitos con Ag A y B.

• · Tipo O: eritrocitos sin Ag A y B.
• Antígenos Rh: recibieron su nombre por haberse identificado inicialmente en los eritrocitos del mono de Rhesus (Macaca Mulatta).
  • Rh+: los eritrocitos poseen un Ag denominado Rho o Ag D. la herencia de este carácter sigue siendo una transmisión mendeliana de forma en que los genotipos DD (homocigoto dominante) y Dd (heterocigoto) son Rh+.
  • Rh -: los eritrocitos no poseen el Ag Rho o Ag D. las personas con fenotipos Rh- presentan genotipo dd (homocigoto recesivo).

Para determinar que antígenos están presentes y, por tanto, a qué grupo sanguíneo pertenece la sangre, se ponen en contacto con anticuerpos monoclonales. Para la determinación de grupos sanguíneos:

• Desinfectar el dedo medio o lóbulo de la oreja y se pincha con una lanceta estéril hasta obtener tres gotas que se colocan separadas sobre una placa de vidrio.
• Se añade una gota de antisuero A sobre la primera gota y se mezcla.
• Se añade una gota de antisuero Rh sobre la segunda gota y se mezcla.
• Se añade una gota de antisuero B sobre la tercera gota y se mezcla.
• Se observa cada gota pata ver si alguna se ha producido una reacción de aglutinación. Se puede ver por debajo de la placa a simple vista, o en caso de duda, a microscopio.

Técnicas de aglutinación indirecta

A diferencia de la aglutinación directa, en esta se emplean antígenos inicialmente solubles, que hay que insolubilizar por fijación a un soporte solido inerte o a una célula. De esta manera se conforma un antígeno particulado (partícula sensibilizada con el antígeno).

Las técnicas más habituales son la aglutinación en látex en placa y la hemaglutinación indirecta, así como una variante de esta última: la inhibición de la hemaglutinación.

• Aglutinación de látex en placa: una de las técnicas de aglutinación indirecta que más se usan es la aglutinación de látex en placa.

La reacción positiva se percibe por la aparición de un moteado característico, ausente en la reacción negativa.

Normalmente, la técnica es cualitativa, pero puede convertirse en semicuantitativa si se lleva a cabo con diluciones seriadas de un suero.

Las partículas de látex son pequeñas esferas de poliestireno suspendidas en un tampón sobre las que se pueden unir antígenos o anticuerpos solubles por interacciones hidrofóbicas. De esta manera se quedan "sensibilizadas" y se pueden usar para la detección de anticuerpos o antígenos.

La técnica es muy sencilla y se puede usar en condiciones de campo, mezclando ambos reactivos y efectuando la lectura por la observación de la formación de agregados visibles en los positivos, que hacen que la suspensión pierda el aspecto lechoso uniforme. Una reacción de aglutinación en látex de uso frecuente en el laboratorio clínico es la determinación de anticuerpos antiestreptolisina O (Ac ASO):

• Estreptolisina O: enzima inmunogenica y toxica producida por estreptococos B hemolíticos de los grupos A, B y G.
• Determinación de Ac ASO en suero: se aplica al diagnostico de fiebre reumática, glomerulonefritis aguda y otras infecciones estreptocócicas.
• Kits comerciales: proporcionan los reactivos necesarios y la técnica es muy sencilla y no requiere equipamiento.

• Hemaglutinación indirecta (HAI): se usa como soporte los antígenos de los hematíes convenientemente tratados. No se trata de antígenos de los propios hematíes, como ocurre con la hemaglutinación directa, sino de los hematíes como soporte para unirles antígenos de distinta procedencia frente a los que se buscan anticuerpos específicos.

La HAI se realiza en placa de micrtitulación con diluciones seriadas de los sueros.

Para la lectura, la aparición de un velo rosáceo supone un resultado positivo, dado que los hematíes están agregados por los anticuerpos; mientras que, la presencia de un anillo o botón de color rojo se interpreta como negativo ya que no existen anticuerpos específicos por lo que, los hematíes no se aglutinan y sedimentan.

Estas técnicas requieren del uso de un control negativo para comprobar que las hemaglutininas en el suero problema. En el pocillo para el control negativo se deposita cuero problema y se añade hematíes no sensibilizados.

Resultado positivo: indica que los hematíes han sido agregados por anticuerpos naturales (hemaglutininas). Un resultado positivo con los hematíes sensibilizados no tendrá ningún valor debido a que no es posible discriminar si la aglutinación se debe a la reacción Ag - Ac.

Ante un positivo en el control negativo, hay que repetir la reacción, pero preincubando el suero problema con hematíes no sensibilizados para eliminar las hemaglutininas.

• Inhibición de la hemaglutinación (IHA): es una variante de la técnica de hemaglutinación indirecta. La hemaglutinación se debe a la capacidad que tienen algunos virus y bacterias de unirse a receptores de membrana de hematíes de mamíferos y aves. Esto se puede aprovechar para detectar en un suero problema anticuerpos específicos frente a esos virus o bacterias.

En ausencia de anticuerpos específicos, los antígenos del patógeno provocarían la aglutinación de los eritrocitos.

Por el contrario, si se incuban esos patógenos con el suero de un paciente que contenga anticuerpos específicos, los anticuerpos neutralizarían los antígenos bacterianos o víricos inhibiendo su capacidad para aglutinar hematíes.

La lectura es, por tanto, lo contrario de las pruebas de aglutinación.

En el diagnóstico de la rubeola, la formación de un velo en los pocillos indica un resultado negativo, es decir, que no existen anticuerpos antirrubeola en el suero problema. En cambio, la aparición de un botón en el fondo del pocillo es un positivo porque la inhibición de la hemaglutinación indica la presencia de anticuerpos específicos antirrubeola en el suero problema, que se unen a las partículas víricas inhibiendo así su capacidad aglutinante de los hematíes.

• Pruebas de Coombs: basadas en una reacción de hemaglutinación, estas pruebas usan el reactivo de Coombs, que es un antisuero animal contra globulinas humanas y que contiene anticuerpos contra las inmunoglobulinas humanas.

Cuando se incuba con eritrocitos lavados del paciente, el reactivo de Coombs provoca su aglutinación. Existen dos variantes:

• La prueba de Coombs directa que permite la detección de anticuerpos unidos a los eritrocitos: aplicaciones en el diagnostico de anemias autoinmunes o de anemia hemolítica en un recién nacido Rh positivo de una madre Rh negativo.
• Prueba de Coombs indirecta permite la detección de inmunoglobulina anti - Rh en el suero materno: se incuba el suero problema con hematies Rh positivo, si hay IgG anti - Rh se uniran hematíes y al añadir el reactivo de Coombs, se producirá la aglutinación de los hematíes. También se usa para detectar algunos grupos sanguíneos como el antígeno Duffy.

Técnicas de precipitación

Se basan en la reacción de la precipitación que ocurre cuando el antígeno soluble multivalente se une con su anticuerpo especifico, dando lugar a inmunocomplejos que precipitan en el medio de la reacción. Es decir, dos componentes que por separado son solubles, precipitan cuando se unen para forman un inmunocomplejo.