Técnicas analíticas de confirmación en toxicología forense

Técnicas Analíticas de Confirmación en Toxicología Forense

TECNICAS ANALITICAS Tox. 33 TEMA 33º: TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONFIRMACIÓN. TIPOS. DESCRIPCIÓN Y UTILIDADES. COMPARACIÓN ENTRE LAS DISTINTAS TÉCNICAS, VENTAJAS E INCONVENIENTES EN TOXICOLOGÍA FORENSE.

• TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONFIRMACIÓN. TIPOS. DESCRIPCIÓN Y UTILIDADES. COMPARACIÓN ENTRE LAS DISTINTAS TÉCNICAS, VENTAJAS E INCONVENIENTES EN TOXICOLOGÍA FORENSE.

En la actualidad existe una gran variedad de técnicas a disposición del toxicólogo que abarcan desde los clásicos métodos no instrumentales (reacciones colorimétricas, tests microcristalinos, etc.), hasta los métodos instrumentales más sofisticados.

El análisis químico ha experimentado en los últimos años un considerable desarrollo, caracterizado por el empleo de instrumentos, más o menos complejos, capaces de medir sus propiedades físicas o químicas que permiten la identificación de los compuestos químicos. Estas técnicas instrumentales presentan indudables ventajas sobre los métodos analíticos clásicos, aunque también tienen ciertas limitaciones que concretan su campo de aplicación.

Dado el elevado número de técnicas instrumentales existentes y la complejidad de algunas de ellas, sólo se hará referencia a las de mayor utilidad en el análisis toxicológico, con una somera descripción de sus fundamentos y principales aplicaciones.

Técnicas Espectrofotométricas

Un sensible perfeccionamiento de las técnicas espectroscópicas lo ha constituido la aparición de modernas técnicas ESPECTROFOTOMÉTRICAS, que se basan en la capacidad que tienen las moléculas y los átomos de absorber radiaciones de diferente longitud de onda, característica para cada sustancia, utilizando la energía de dichas radiaciones para producir cambios energéticos en su estructura.

En los átomos estos cambios se refieren exclusivamente a transiciones electrónicas. En las moléculas los cambios energéticos son debidos a movimientos electrónicos, así como a movimientos de vibración y rotación de la molécula.

Su APLICACIÓN en Toxicología Forense consiste en el análisis cualitativo y cuantitativo de soluciones coloreadas (ya sea natural o artificialmente). 1TECNICAS ANALITICAS Tox. 33 El aparato técnico consiste en el espectrofotómetro cuya ventaja es la rapidez con que se realizan todas las operaciones y la exactitud extrema de las medidas, razón por la cual el aparato es imprescindible en todos los laboratorios de investigación y de análisis químico.

En esencia se compone de las siguientes partes:

• Fuente luminosa cuya intensidad se mantiene constante, por diversos artificios a lo largo de todas las lecturas.
• Sistema de monocromados que es capaz de situar sucesivamente ante una rendija del colimador una radiación de onda muy definida, para lo cual puede utilizarse prismas o filtros espectrales.
• Célula fotoeléctrica que mide la intensidad de la radiación.

Para medir la intensidad de absorción de una sustancia problema hay que determinar la cantidad de luz que incide sobre la célula fotoeléctrica, antes y después de interponer dicha sustancia problema en el camino de la radiación monocromatica. La diferencia indica la intensidad de la absorción. La absorción se expresa en coeficientes de extinción (logaritmo decimal de la opacidad correspondiente a un cm. de espesor de la solución).

Mediante el espectrofotómetro se obtiene la curva de absorción, que es una gráfica que se obtiene realizando una lectura para cada longitud de onda y que define perfectamente las variaciones de absorción a todo lo largo del espectro. Las curvas de absorción son específicas para cada sustancia.

La Ley de Beer-Lambert dice que la intensidad de absorción de la luz por la sustancia existente en la solución es directamente proporcional al número de moléculas (concentración y espesor) de la sustancia disuelta; lo que permite realizar una determinación cuantitativa.

Las técnicas espectrofotométricas son fundamentalmente de cinco tipos:

• Espectrofotometría ultravioleta visible.
• Espectrofluorimetría.
• Espectrofotometría infrarroja.
• Espectrofotometría de absorción atómica.
• Espectrofotometría de masas.
• Espectrofotometría Emisión de Plasma

Espectrofotometría Ultravioleta Visible

La absorción de energía radiante por un compuesto orgánico da origen a transiciones electrónicas en las moléculas, de manera que la frecuencia de la absorción está relacionada con la diferencia de energía 2TECNICAS ANALITICAS Tox. 33 entre el orbital ocupado originalmente por el electrón y el que ocupa después de ser excitado:

Puesto que las transiciones electrónicas van acompañadas por cambios en las energías de vibración y rotación, la banda de absorción resulta más ancha que si sólo el electrón estuviera implicado en el proceso.

Cuando la luz pasa a través de una solución que contiene una sustancia capaz de absorber, una parte es absorbida, por otra parte es reflejada y el resto es transmitido.

La cantidad de luz absorbida (absorbancia o densidad óptica de la solución) es proporcional a la concentración de la solución y a la longitud del camino recorrido a través de aquella. Esta relación viene definida por la ley de Lambert- Beer, que en su expresión práctica se puede expresar como: DO = Ex c xl siendo c la concentración molar de la solución, l el camino recorrido por la luz y E el coeficiente de absorción molar.

Las aplicaciones derivan del hecho de que las transiciones electrónicas en una molécula dan origen a bandas de absorción específicas a determinadas longitudes de onda, que pueden ser usadas para la identificación de la molécula. Sin embargo, como las bandas de absorción ultravioleta son en general anchas, una misma señal puede ser manifestada por diferentes compuestos, lo cual dificulta la identificación de la molécula. Esta técnica es sólo orientativa, aunque el estudio de la absorción inespecífica en la región de 200 - 400 nm, junto con la observación de las variaciones que originan en dicha absorción los cambios de pH, puede servir para la identificación aproximada de un problema haciendo uso de los datos tabulados de que se dispone.

La intensidad de la absorción, es una medida de la concentración de la entidad absorbente presente en una muestra. La construcción de curvas de calibración, usando patrones de concentración conocida, permite realizar una cuantificación precisa de los problemas.

Espectrofluorimetría

Fluorescencia es el proceso de emisión de luz que acompaña la transición espontánea de una molécula o átomo, desde el estado excitado hasta el nivel de menor energía. Este proceso de emisión puede ocurrir directamente en un tiempo del orden de 10-9 seg. o a través de un período de tiempo mayor (10-3). En el primer caso se llama fluorescencia y en el segundo, fosforescencia.

La fluorescencia de un compuesto orgánico depende de la naturaleza del esqueleto carbonado, de la disposición geométrica de la molécula y del tipo y de la posición de los sustituyentes. Así pues se distinguen varios tipos de ensayos fluorimétricos:

• Medida de la fluorescencia nativa.
• Inducción química de la fluorescencia. 3TECNICAS ANALITICAS Tox. 33
• Inhibición de la fluorescencia.

La espectrofluorimetría presenta dos ventajas como son la sensibilidad que es inherente al propio diseño del instrumental utilizado y la especificidad que se debe al hecho de que se utilice para la identificación de una sustancia tanto el máximo de absorción como la emisión de fluorescencia, frente al máximo de absorción, que es el único parámetro que se emplea en los métodos espectrofotométricos convencionales.

Encuentra aplicación en ensayos cualitativos y cuantitativos, de forma semejante a lo visto en la espectrofotometría ultravioleta. Entre las aplicaciones típicas tenemos las determinaciones de fenotiacinas, benzodiacepinas, salicilatos, opiáceos, alucinógenos, etc.

Espectrofotometría Infrarroja

Es uno de los métodos más usados para la identificación de compuestos desconocidos. Un espectro infrarrojo puede obtenerse en menos de 2 min. y la muestra no es alterada ni destruida. Cada compuesto produce un espectro diferente, de forma que un espectro infrarrojo es equivalente a una huella dactilar de la sustancia examinada. Todos los compuestos orgánicos y algunos inorgánicos absorben luz en la región infrarroja del espectro electromagnético.

Cada grupo funcional químico tendrá unas frecuencias características que servirán para identificarlos en una sustancia desconocida. Esas frecuencias características se denominan frecuencias de grupo y son ejemplos típicos: OH, NH, C=O, C=N, C-O-C, C=C, etc. Por ello un espectro infrarrojo puede dar con rapidez información sobre la presencia o ausencia de ciertos grupos funcionales, o características estructurales, presentes en un compuesto desconocido.

Las aplicaciones son el análisis cualitativo, debiendo utilizarse espectros de referencia y datos tabulados para su interpretación. El espectro infrarrojo presenta un doble problema: por un lado, requiere una gran pureza de la muestra y, por otro, se necesita una cantidad de muestra algo elevada, debido a la dificultad de manipulación de dichas muestras. Por todo ello, en la actualidad el uso de esta técnica en Toxicología encuentra su mayor aplicación en combinación con la cromatografía de gases.

Espectrofotometría de Absorción Atómica

Es un método analítico para determinar la concentración de elementos metálicos en una matriz determinada. Se basa en el hecho de que los átomos en estado fundamental de cada elemento absorben luz monocromática proporcionalmente al número de átomos presentes, a una longitud de onda característica del elemento en cuestión. Los elementos metálicos presentes en una muestra son reducidos a su estado fundamental por el proceso de disociación de la llama. 4TECNICAS ANALITICAS Tox. 33

La energía de una lámpara de cátodo hueco emite el espectro característico del elemento que nos interesa, que pasa a través de la llama donde se encuentra disperso el elemento. La energía requerida para obtener la nube atómica puede conseguirse con la llama, mediante el empleo de mezclas oxidante- combustible.

Otra modalidad de espectrofotometría de absorción atómica está representado por el horno de grafito. En este dispositivo la energía requerida para la atomización se consigue mediante la aplicación de una diferencia de potencial eléctrico a través de un tubo de grafito, dentro del cual se ha colocado la muestra. Sus principales ventajas son la sensibilidad y el requerimiento de una minima cantidad de muestra.

Su APLICACIÓN en Toxicología Forense consiste en la determinación cuantitativa de ciertos elementos metálicos, especialmente indicada en:

• La determinación de metales alcalinos y alcalinotérreos (bario, estroncio y calcio) encontrados en tejidos animales y suero sanguíneo.

'Determinación del hierro, cobre y zinc que juegan un papel importante catalizando diversas transformaciones biológicas.

• Determinación de oligoelementos ampliamente distribuidos en la naturaleza.
• Determinación de diversos tóxicos que pueden contaminar alimentos y productos biológicos (arsénico, mercurio, plomo, cadmio, manganeso).

Espectrometría de Masas

Está relacionada con la producción de iones y la subsiguiente fragmentación de las moléculas, así como con la determinación de las razones masa / carga y la abundancia relativa de los iones producidos.

Los grupos funcionales de una molécula determinan la fragmentación, de manera que conociendo la estructura de la molécula, es posible predecir el patrón de la fragmentación. Inversamente, conociendo el patrón de fragmentación se puede sugerir una estructura para la molécula original. Además, la técnica permite determinar el peso molecular, lo que constituye la información más valiosa de un espectro de masas.

Sus aplicaciones son fundamentalmente cualitativas, aunque también puede utilizarse con fines cuantitativos. En la actualidad la espectrometría de masas, sola o en combinación con la cromatografía de gases es el método más efectivo para la identificación de tóxicos y sus metabolitos. La especificidad y sensibilidad de esta técnica permiten obtener un espectro completo y, en muchos casos, una identificación precisa, con menos de 50 nm de material.

Las determinaciones cuantitativas permiten detecciones en el ámbito de picógramos e incluso de fentogramos, aunque en los análisis toxicológicos su principal aplicación es la identificación de sustancias 5