Citogenética y técnicas de hibridación, Claudio Galeno Formación Profesional en Salud

MP03 - Biología molecular y citogenética

UF1. Citogenética y técnicas de hibridación MP03 - Biología molecular y citogenética CLAUDIO GALENO GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD MP03 - BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA 1 FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUDMP03 - BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA CLAUDIO GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD

Índice de la UF1

UF1 .- Citogenética y técnicas de hibridación (55h)

1. Cultivos celulares
2. Principios básicos de citogenética
3. Citogenética humana y análisis cromosómico

GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD MP03 - BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA 2UD1. Cultivos celulares MP03 - Biología molecular y citogenética CLAUDIO GALENO GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD MP03 - BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA 3 FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUDÍNDICE CLAUDIO GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD

UD1 - Cultivos celulares

1. Introducción
   • Tipos de cultivos celulares
   • Aplicaciones de los cultivos celulares
2. Biología de las células en cultivo
   • La curva de crecimiento del cultivo
   • Formas de crecimiento Comportamiento vital tras sucesivos pases
3. Factores que intervienen en el cultivo
   • El soporte físico
   • Composición y propiedades del medio de cultivo La atmósfera gaseosa
   • Condiciones de incubación
4. Procedimientos de cultivo celular
   • Disgregación celular
   • Recuento y viabilidad celular
   • Conservación de células
5. Contaminaciones

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Introducción a los cultivos celulares

Además de la biología molecular, uno de los ámbitos de estudio importantes son los cultivos celulares en laboratorio, es decir, en medios y condiciones controladas. Se puede definir el cultivo celular como el conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células de organismos pluricelulares in vitro, preservando al máximo sus características fisiológicas, bioquímicas y genéticas. El laboratorio en el que tiene lugar la propagación o crecimiento de células de organismos pluricelulares en medios de cultivo artificiales y en condiciones controladas es el laboratorio de cultivos celulares. Órganos Disección Disgregación I Cutivo de células Cultivo de órganos Cultivo de explantes Fig. 10.1. Esquema de la obtención de los distintos tipos de cultivo celular a partir de los órganos de un animal. MP03 - BIOLOGIA MOLECULAR Y CITOGENETICA GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD 5CLAUDIO GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD

Tipos de cultivos celulares

Según la definición de cultivos celulares que se ha dado en el apartado anterior, se pueden diferenciar tres tipos:

• Cultivo de órganos > Consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la interfase entre un medio de cultivo artificial y una atmósfera controlada.
  • En estos cultivos (como cultivos de ganglios, fragmentos hepáticos, piel, médula ósea ... ) se suelen mantener vivos, durante un tiempo limitado, los distintos tipos celulares diferenciados presentes en el órgano, así como la estructura histológica y arquitectura del órgano.
  • No pueden propagarse, ya que la mayor parte de los tipos celulares no proliferan.
  • Se utilizan para estudiar interacciones y relaciones intercelulares, respuestas globales a estímulos y sustancias, estudios regenerativos ...
• Cultivo de explantes > Consisten en adherir un fragmento de tejido a una superficie (placa o frasco de cultivo) y nutrirlo con un medio de cultivo.
  • En estas condiciones, las células periféricas del explante se multiplican y proliferan (como pueden ser vellosidades coriónicas, tejidos epiteliales ... ).

INGUARDIA MX Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants a . Cells grow around explant b GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD MP03 - BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA 6CLAUDIO GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD

Tipos de cultivos celulares (continuación)

Según la definición de cultivos celulares que se ha dado en el apartado anterior, se pueden diferenciar tres tipos:

• Cultivo de células > Se realiza a partir de suspensiones celulares, que se introducen en un recipiente adecuado junto con un medio de cultivo y se incuban en las condiciones óptimas para que las células proliferen. Es el tipo de cultivo más habitual y se realiza a partir de muestras de cualquier tipo de tejido, restos ovulares, líquido amniótico, sangre periférica, células hematopoyéticas, células madre ... Según la procedencia de la suspensión celular de partida, los cultivos celulares pueden ser:
  • Cultivo celular primario > La suspensión celular de partida se obtiene disgregando las células de un tejido por métodos mecánicos o enzimáticos. De esta manera se obtiene una mezcla celular compleja formada por los distintos tipos celulares presentes en el tejido. Se puede realizar el cultivo a partir de esta mezcla o seleccionando un tipo celular concreto.
  • Cultivo celular secundario > La suspensión celular de partida se obtiene a partir de un cultivo primario o de otro secundario, mediante un subcultivo o más conocido como "pase". También se puede obtener a partir de una línea celular mantenida en congelación.

Se está haciendo carne a partir de cultivos celulares GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD Un grupo de células con un mismo origen, estructura o función constituyen un mismo tipo celular. En el proceso de disgregación de un órgano o tejido se obtiene diferentes tipos celulares. 7CLAUDIO GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD

Aplicaciones de los cultivos celulares

Los cultivos celulares tienen múltiples aplicaciones, tanto en investigación básica, como en investigación aplicada. APLICACIONES EN INVESTIGACIÓN BÁSICA APLICACIONES EN INVESTIGACIÓN APLICADA OTRAS APLICACIONES Los cultivos celulares permiten estudiar cualquier aspecto relacionado con el metabolismo celular: ciclo celular, rutas metabólicas, flujos intracelulares, diferenciación, transformación ... Muy importantes en la producción de anticuerpos monoclonales en inmunología. La ingeniería de tejidos pretende conseguir la producción in vitro de tejidos (cultivos histotípicos) y órganos (cultivos organotípico) funcionales para su uso en injertos y trasplantes. También permiten estudiar interacciones celulares entre células o con la matriz extracelular o con el medio ambiente. Para la producción de vacunas en virología. Estudios con células madre o stem cells, enfocados a la terapia celular. Para la producción de fármacos en farmacología. Interesante en toxicología, para estudios de citotoxicidad, carciongénesis y mutagénesis. GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD 8CLAUDIO GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD

Biología de las células en cultivo

Una vez que a las células en suspensión se les añade el medio de cultivo, se introducen en un recipiente adecuado (frasco de cultivo) y se incuban en condiciones óptimas de temperatura y humedad, empiezan a crecer.

La curva de crecimiento del cultivo

La dinámica de crecimiento de un cultivo, es decir, la concentración de células por los días de evolución del cultivo, se representa gráficamente mediante una curva de crecimiento. La curva de crecimiento adopta la forma de una curva sigmoide en la que se diferencias tres fases:

• Fase de latencia > Tramo recto sin pendiente. Corresponde a las primeras 24horas de evolución del cultivo en las que no se produce crecimiento y, por tanto, el número de células se mantiene constante o incluso puede disminuir ligeramente.
• Fase de crecimiento exponencial > Es el tramo recto con pendiente elevada. Dura aproximadamente 6-7 días y corresponde a la fase en la que el número de células aumenta de manera exponencial hasta alcanzar un máximo.
• Fase estacionaria -> Es un tramo recto de pendiente nula. Sucede a partir de los 6-7 días de evolución del cultivo y es la fase en la que el número de células permanece constante (se para el crecimiento por falta de alimento o demasiada densidad celular).

Subcultivo Fase estacionaria Fase exponencial Células/ml Fase de latencia 1 3 5 7 9 11 Días de cultivo Fig. 10.3. Curva de crecimiento de un cultivo, en la que se observan las fases de latencia, exponencial y estacionaria. El momento idóneo para realizar un subcultivo es al final de la fase exponencial. GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUDCLAUDIO GALENO FORMACIÓN PROFESIONAL EN SALUD

Formas de crecimiento: Crecimiento en monocapa

CRECIMIENTO EN MONOCAPA Consiste en que las células crecen adheridas sobre una superficie sólida (plástico o vidrio). Este tipo de células se dice que son dependientes de anclaje, es decir, que necesitan adherirse a una superficie para poder crecer. Es el método utilizado en la mayoría de las células y se diferencian diferentes etapas de desarrollo:

• Adhesión a una superficie > Coincide con el periodo de latencia de la curva de crecimiento, momento en que las células se unen al soporte.
• Proliferación y formación de colonias > Corresponde a la fase exponencial de la curva de crecimiento. Una vez adheridas, empiezan a proliferar, expandiéndose por toda la superficie y formando colonias celulares.
• Inhibición por contacto > Momento en que se entra en la fase estacionaria de la curva de crecimiento, ya que las células ocupan toda la superficie disponible y entran en contacto entre ellas. Al tocarse, se produce un fenómeno llamado inhibición por contacto, que provoca que las células detengan su crecimiento, aunque se mantienen vivas. En este momento es cuando las células se parecen más a su morfología y fisiología original. Para que las células retomen su crecimiento se necesita hacer un subcultivo o "pase" de estas a un nuevo frasco de cultivo. El momento ideal para realizarlo es al final de la fase exponencial.

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Formas de crecimiento: Crecimiento en suspensión

CRECIMIENTO EN SUSPENSIÓN Consiste en que las células no necesitan adherirse a una superficie para crecer, por lo que se mantienen dispersas en un medio de cultivo y proliferando. Este crecimiento es típico de células sanguíneas circulantes, hematopoyéticas, células madre, algunas líneas tumorales y algunas líneas celulares transformadas (clonación molecular). Podemos distinguir diversas etapas de desarrollo:

• Adaptación al medio de cultivo > Coincide con el periodo de latencia de la curva de crecimiento, momento en que las células se adaptan al medio y a las condiciones de cultivo antes de empezar a crecer. Es una fase relativamente corta.
• Proliferación en suspension > Corresponde a la fase exponencial de la curva de crecimiento. Una vez adaptadas, empiezan a proliferar aumentando exponencialmente en número.
• Inhibición por densidad > Momento en que se alcanza un número crítico de células en relación con el volumen de medio de cultivo y los nutrientes que quedan en él. Se produce el fenómeno llamado inhibición por densidad, las células dejan de crecer para no careceré de nutrientes para todas, pero las que hay siguen vivas. Momento en que se entra en la fase estacionaria de la curva de crecimiento. 0000 Al igual que en los cultivos monocapa, para que las células retomen su crecimiento se debe hacer un subcultivo o "pase" de estas a un nuevo medio de cultivo. El momento ideal para realizarlo es al final de la fase exponencial.

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