Appunti di Istologia: tessuti, sangue e preparazione materiale istologico

ISTOLOGIA

INTRODUZIONE

Istologia= studio dei tessuti (dal greco). Cellula -> tessuti -> organi -> apparati/sistemi Si parla di apparato quando gli organi sono diversi e collaborano tra di loro come l'apparato riproduttore, invece si parla di sistema quando un organo si dirama in più parti come nel caso del sistema scheletrico.

Ci sono 4 tipi di tessuto: epiteliale, connettivo (propriamente detto e specializzato), muscolare, nervoso. Epiteliale comprende la superficie esterna del nostro corpo e la superficie interna che ricopre le cavità. Connettivo collega organi e tessuti tra di loro e si divide in tessuto connettivo propriamente detto, che comprende tessuti che collegano gli organi tra di loro, e il tessuto connettivo specializzato, che comprende il sangue (unico tessuto fluido), la cartilagine e le ossa. Quest'ultimi hanno la composizione di base simile al tessuto connettivo ma in più hanno delle caratteristiche specifiche.

Tutti i tessuti (solidi e fluidi) sono formati da due componenti principali: le cellule e la matrice extracellulare. I rapporti delle cellule tra loro e la composizione, consistenza della matrice formano i tessuti specifici.

L'istologia quindi studia questi rapporti nei tessuti attraverso strumenti e colorazioni a livello microscopico.

Le cellule e i tessuti possono essere studiati a livello morfologico, biochimico e funzionale.

ANALISI MORFOLOGICA

L'analisi morfologica mi da informazioni su forma, dimensione, distribuzione, rapporti e sulla struttura.

Mandibola di feto umano a termine. Tessuto adiposo unilocul o umano a termine. Tessuds adiposo uniloculare. La cellula adiposa & porugara quase esclusivamente da una grossa gocciolina lipidica, il citoplasma è rappresentato solo da un somię anedo che circonda la gocciolina, a nucleo è allungato, piccolo e schiacciato in perilera. La gocciolina lipidica è stata estata durante la processazione del preparato da alcool e solventi organici, per cui nell'adicocita è rimania solo l'impronta incolore della goccioina lipidica. Azan Mallory 160x

tessuto adiposo, tessuto muscolare scheletrico, sangue, cartilagine ??

Preparazione materiale istologico

Il primo passaggio è il prelievo del tessuto, che deve avvenire rapidamente, e subito dopo bisogna fissarlo per non farlo andare incontro a processi degenerativi che provocano alterazioni del tessuto. La fissazione serve ad impedire la degenerazione dei tessuti per autolisi e mantiene il più possibile inalterato il loro quadro strutturale e quindi fornisce un'immagine statica.

Un fissativo ideale deve garantire: una sicura preservazione della morfologia di base, deve impedire la degradazione e quindi mantenere la struttura antigenica (componenti molecolari), deve impedire alterazioni biochimiche del tessuto e deve impedire i processi automatici e putrefattivi.

In seguito alla fissazione bisogna procedere con la disidratazione, eliminando quindi acqua. Si può utilizzare la formaldeide per non modificare la morfologia delle cellule e dei tessuti e Invece per analisi molecolari si utilizza l'alcol o l'acetone. L'alcol in realtà rovina la struttura cellulare perché avendo come membrana plasmatica un doppio strato di fosfolipidi si creeranno dei "buchi", ma è utile per conoscere la composizione biochimica delle cellule in esame. La disidratazione, oltre a mantenere come la fissazione lo stato vitale dei tessuti, permette di far assorbire alle cellule la paraffina (cera insolubile in acqua) con il passaggio successivo, ovvero l'inclusione. Per disidratare bisogna fare dei passaggi in alcol a diverse concentrazioni fino a raggiungere il 100% (vedi immagine) e infine si aggiunge un solvente simile alla paraffina (la quale scaldata diventa liquida).

1SOFIA ARENA ISTOLOGIA 1 SEMESTRE

1. Prelievo organo

4 - Disidratazione - serie ascendente degli alcol Alcol 50° Alcol 75° Alcol 956 Alcol 100° | Alcol 100° II Fissa- tivo 1-24 ore 1-24 ore 1-24 ore 1-24 ore 1-24 ore 1-24 ore

1. Lavaggio Acqua O tamponi 1-24 ore

5 - Chiarificazione in solventi organici (xilene - Histolemon) Histolemon Histolemon I 1-24 ore 1-24 ore

L'inclusione o il congelamento (metodo fisico) sono dei passaggi utili ad indurire il tessuto perché la maggioranza di questi sono tessuti molli e per non sfaldare, rompere il tessuto durante il taglio bisogna renderli duri. Come detto precedentemente si puo utilizzare la paraffina liquida oppure delle resine.

In seguito bisogna procedere con il taglio tramite speciali apparecchi detti microtomi (o ultramicrotomo o criostato a -20 gradi) che sezionano il tessuto con uno spessore molto ridotto, il quale varierà per il tipo di analisi da eseguire e per lo strumento utilizzato (microscopio ottico o microscopio elettronico).

Questa sezione dovrà essere molto sottile (s= 3 um) per mettere alla luce del microscopio di attraversare il materiale biologico.

SPECIMEN

Bisogna considerare anche il tipo di taglio in base all'analisi che voglio fare O The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Types of Tissue Sections Longitudinal sections Cross section Longitudinal section Cross sections O Oblique section Oblique sections O Diagram showing the different appearances of sections cut through a curved tube at different levels 2SOFIA ARENA ISTOLOGIA 1 SEMESTRE

Ci sono tre tipi di taglio: longitudinale ovvero parallelo alla lunghezza dell'organo, trasversale perpendicolare all'asse, obliquo.

ES. taglio del muscolo scheletrico 1) trasversale 2) longitudinale 3) obliquo

Slide 63 Tongue Oblique fibers Longitudinal fibers Transverse fibers

In seguito al taglio bisogna rimuovere la paraffina e reidratare il tessuto per far legare i coloranti, i quali sono sempre in soluzione acquosa. Quindi si esegue il processo inverso all'inclusione: si elimina la paraffina con lo xinolo, solvente della paraffina, e poi si eseguono dei bagno a concentrazione decrescente di alcol fino ad arrivare al 100% di acqua.

Prima di poterlo analizzare bisogna procedere con la colorazione perché essendo i tessuti pieni di acqua non si riuscirebbero a distinguere le parti che compongono la cellula e inoltre i tessuti sono normalmente incolori e privi di contrasto. Ad esempio una colorazione istologica è con l'ematossilina e l'eosina perché si basa sull'affinità che questi componenti hanno per i tessuti, in particolare i gruppi acidi e basici. Questi coloranti si legano aumentando il contrasto tra i componenti. Gli elementi cellulari acidi (basofili) si colorano di blu verde, come i nuclei, gli elementi basici (acidofili) si colorano di rosso arancione, in particolare gli eritrociti si colorano di rosso, e gli elementi neutrofili si colorano di violetto chiaro. Questo tipo di colorazione viene definita policromatica.

Quindi prima di analizzare un tessuto al microscopio bisogna eseguire 7 passaggi fondamentali:

1. Prelievo
2. Fissazione
3. Disidratazione
4. Inclusione/congelamento
5. Taglio
6. Sparaffinatura/reidratazione
7. Colorazione
8. (chiusura)

Colorazione

La colorazione è l'ultimo passaggio prima di guardare al microscopio il nostro tessuto in esame. Per colorante si intende una sostanza che si lega ai componenti cellulari o tessutali aumentando il contrasto. Ci sono quattro principali gruppi di coloranti per la microscopia ottica: acidi, basici, neutri, mordenzante.

I coloranti acidi, come l'eosina, hanno affinità per i componenti basici delle cellule ad esempio proteine e altri componenti citoplasmatici, e vengono definiti come acidofili.

I componenti basici, come l'ematossilina, si lega ai componenti cellulari acidi come DNA e RNA che sono quindi basofili.

I coloranti neutri invece sono formati dall'unione di un colorante acido e di uno basico.

3SOFIA ARENA ISTOLOGIA 1 SEMESTRE

Il mordenzante non è propriamente un colorante ma è una sostanza utilizzata per facilitare la fissazione del colorante, solitamente sono ioni metallici.

Inoltre si possono usare delle miscele di coloranti, colorazione bicromica, utilizzando ematossilina-eosina (EE) per evidenziare parti diverse di un solo campione. Ad esempio un'analisi della cute (epitelio stratificato e tessuto connettivo) evidenzia come nella parte superiore ci siano molti più nuclei, che sono basofili (viola scuro), e nella parte inferiore ci sia più matrice, che separa le cellule, la quale è quindi acidofila (violetto chiaro).

EPIDERMIDE Strato corneo Recettori Doloriferi Strato lucido Strato granuloso Dotto sudorifero Strato spinoso Strato basale Recettori tattili Papillare Nervo DERMA Reticolare Capillare Ghiandole sudorifere Vene TESSUTO ADIPOSO SOTTOCUTANEO Recettori di pressione Arteria

N.B. Basofili: nucleo e componenti citoplasmatici come ribosomi e secreti acidi. Acidofili: citoplasma, tessuti basici come il muscolare, il connettivo, l'osseo.

Un alto colorante è l'alcian blue, carico positivamente che forma legami elettrostatici con alcuni composti tessutali legando il gruppo carbossilico o quello solforico (contenuto glicoproteico delle ghiandole). questa colorazione blu evidenzia la mucina, un componente acquoso che contiene glicoproteine. Il colore blu è dato dalla presenza del rame nel colorante (rame ftalocianina) mucine acide in blu, tessuto dell'apparato digerente

Ci sono anche delle colorazioni elettive per il tessuto nervoso, il quale essendo estremamente delicato non può essere trattato come gli altri tessuti. Inoltre una colorazione non specifica non sarebbe efficiente per distinguere i vari componenti per la ricchezza di filamenti e fibre nel tessuto. Ad esempio alcuni metodi specifici sono: il metodo di Golgi, il metodo di Cajal, il metodo di Nissl. Sono colorazioni a spot, random, non colorano tutto il tessuto. In questo modo intorno al neurone si legheranno i metalli (per il metodo di Golgi, cromo-argentica) che evidenziano la struttura e la diramazione della cellula. Il metodo di Golgi e quello di Cajal sono uno l'evoluzione dell'altro infatti quest'ultimo utilizza oltre a metalli pesanti anche degli agenti riducenti.

Diversamente dai primi due, il metodo di Nissl, utilizza dei coloranti basici come il blu di toluidina, il cresil violetto e la tionina, che evidenziano il neurone per la sua attività di sintesi proteica nei ribosomi (basofili) e non perché è attivo per proliferare. Mette quindi in evidenza la sostanza tigroide, caratteristica del citoplasma dei neuroni.

metodo neurofibrillare