Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo primarias

Inmunoensayos

Los inmunoensayos constituyen un conjunto de técnicas de laboratorio con base inmunoquímica. Se realizan a partir de la afinidad de la reacción antígeno-anticuerpo para la cuantificación de un analito, que es uno de los componentes de dicha reacción (Ag o Ac).

• Un anticuerpo puede tener diferentes zonas de unión al antígeno (paratopos) [ Anticuerpo multivalente.
• Un antígeno puede tener diferentes sitios de unión al anticuerpo (epítopos= fragmento de la molécula de un antígeno que es reconocido por el anticuerpo o una célula del sistema inmune. Normalmente son estructuras de superficie).

antige epitope heavy chain paratope light chain Variable (V) regions Constant (C) regions

Cuando tiene lugar la unión antígeno-anticuerpo, que es de carácter reversible, debemos distinguir entre dos conceptos:

• Afinidad: medida de la fuerza de unión Ag-Ac en un solo sitio de unión.
• Avidez: medida de la estabilidad de la unión entre un anticuerpo y su antígeno, y depende de la suma de las fuerzas de unión entre múltiples sitios de unión (epítopos) en el antígeno y los sitios de unión (paratopos) en el anticuerpo.

Para cuantificar una molécula mediante técnicas de inmunoensayo, se requiere un anticuerpo que sea capaz de unirse específicamente a la estructura molecular (el Ac debe unirse solo a ese Ag concreto).

Puede darse el caso de que un mismo anticuerpo se una a epítopos que son parecidos, pero pertenecen a diferentes antígenos Reactividad cruzada = ¡fenómeno a evitar!

Una enzima es una molécula proteica que cataliza una reacción química en la que un sustrato se transforma en un producto.

Inmunoensayos según el número de pasos

• Inmunoensayos directos: se mide directamente el complejo antígeno-anticuerpo formado, puesto que el anticuerpo ya se encuentra marcado. Se hace en un único paso y se suele emplear para la determinación de antígenos.
• Inmunoensayos indirectos: requieren la labeled antibody Antigen Enzyme Enzyme labeled antibody Antigen primary antibody 3 1 solid platerealización de una segunda reacción con materiales marcados para poder cuantificar la concentración del complejo. Se emplea para la determinación de anticuerpos y requieren más de una etapa.

Tipos de inmunoensayos

Según el fundamento de la técnica:

• Inmunoensayos NO competitivos: se emplea un anticuerpo marcado que se une específicamente al analito (que es su antígeno). En principio, cuanta mayor cantidad de antígeno presente, más anticuerpos se unirán a el y más señal se detectara. I Directamente proporcional señal vs [analito]. Cabe destacar que, al igual que podemos emplear un anticuerpo marcado para detectar un antígeno en concreto, también podemos utilizar antígenos marcados para la detección de anticuerpos. Pueden ser directos, indirectos o tipo sándwich. Directo Indirecto Sándwich Secondary antibody Secondary antibody conjugate Primary antibody conjugate Antiger Primary antibody Primary antibody Antigen Antigen

Según el fundamento de la técnica:

• Inmunoensayos competitivos: un analito análogo marcado compite con el que se quiere cuantificar por la unión al anticuerpo. El antígeno marcado y el anticuerpo se añaden en una cantidad determinada. Por norma general, cuanto mayor sea la concentración de analito (antígeno no marcado), menor va a ser la señal observada, puesto que hay menos anticuerpo disponible para unirse al antígeno marcado Inversamente proporcional señal vs [analito]. Al igual que en caso anterior, también se puede utilizar esta técnica para la determinación de anticuerpos, añadiendo el antígeno correspondiente y otro anticuerpo análogo marcado que compita con el que queremos determinar. En los ensayos competitivos, el epítopo de unión entre el componente marcado y el no marcado debe ser el mismo, para que no se produzcan discrepancias en la afinidad de la unión (Ag *- Ac = Ag-Ac).

2Según el fundamento de la técnica:

• Inmunoensayos competitivos: pueden ser de un paso y de dos pasos. Inmunoensayo competitivo de un paso El antígeno marcado (Ag*) y el analito sin marcar (Ag) se hacen reaccionar a la vez con una cantidad limitada de anticuerpo (Ac). Los tipos de uniones que pueden ocurrir son: Ag *- Ac y Ag-Ac. La proporción entre una y otra se relaciona con las concentraciones de antígeno libre (Ag) y marcado (Ag*). YYY+

Según el fundamento de la técnica:

• Inmunoensayos competitivos: pueden ser de un paso y de dos pasos. Inmunoensayo competitivo de dos pasos El anticuerpo (Ac) se incuba primero con la muestra que contenga el antígeno de interés (Ag). De esta forma, todo el analito presente puede unirse y formar el complejo Ag-Ac. Tras este paso, se añade el antígeno marcado (Ag*), que solo se podrá unir al anticuerpo que quedó libre, formando el complejo Ag *- Ac.

Inmunoensayos según el método de separación

• Inmunoensayos heterogéneos: requieren la separación de los inmunocomplejos y las moléculas no conjugadas. Normalmente usan un reactivo de fase sólida al cual se fijan los complejos. La separación de las moléculas no conjugadas se suele realizar mediante lavados. Se consigue así eliminar el exceso de Ag o Ac que pueda interferir con los siguientes pasos del análisis. lavado
• Inmunoensayos homogéneos: no requieren la separación de los inmunocomplejos de las moléculas libres de Ag y/o Ac que no se han conjugado. Normalmente se basan en una activación o inhibición de la actividad enzimática como consecuencia de la formación del imnunocomplejo. VS

3Según el tipo de marcaje:

• Radioinmunonesayos La reacción entre antígeno y anticuerpo se manifiesta por métodos radiológicos. El anticuerpo se marca con un isótopo radiactivo
• Fluoroinmunoensayos El anticuerpo se marca con un fluorocromo, y se detecta la formación del complejo por la fluorescencia emitida.
• Enzimoinmunoensayos El anticuerpo se marca con una enzima que cataliza una reacci en la que un sustrato incoloro transforma en un producto coloreado.

Según el número de pasos: Directo Indirecto

Según el fundamento de la técnica: Competitivo No competitivo

Según el método de separación: Homogéneos Heterogéneos

Según el tipo de marcaje: Radioinmunoensayos Fluoroinmunonesayos Enzimoinmunoensayos

Representación de datos y obtención de resultados

Existen dos medios a través de los cuales se obtienen los resultados de los inmunoensayos:

• Expresando el valor medido en un formato normalizado: el aparato nos da el valor de concentración del analito directamente en unidades estandarizadas, como ng/ml, sin necesidad de realizar una extrapolación a partir de una curva de calibración. A menudo incluyen controles internos de calidad que se miden junto con las muestras para verificar la precisión del método. 0.25 0.20 0.15 std 0.10 0.05 0 0 0.0020 0.0040 0.0060 C ... (M)
• Obteniendo el resultado por extrapolación en una curva patrón: se elabora una curva de calibrado utilizando estándares de concentración conocida. La concentración del analito en la muestra se obtiene extrapolando el resultado obtenido en la curva.

La intensidad de señal y la concentración de analito/antígeno son dos parámetros que presentan una relación mantenida pero no lineal, debido a que la reacción experimenta un proceso de saturación.

La saturación de una reacción se entiende como el punto en el que la reacción ya no admite más sustrato. Es decir, uno de los componentes (ya sea antígeno o anticuerpo) está completamente unido, de forma que, aunque se aumente la cantidad del otro, no ocurre más reacción. Por lo tanto, existirá un reactivo limitante. Por mucho que aumente la concentración del analito, la intensidad se mantiene. Cantidad de productos formado Tiempo

Curva de calibrado

Utiliza una serie de diluciones en las que el analito se encuentra a una concentración conocida y creciente. Estas soluciones reciben el nombre de calibradores y pueden ser comerciales o crearse manualmente.

El calibrador es una mezcla que contiene una cantidad conocida del analito a cuantificar. Su utilización permite generar la curva de calibración.

0.25 0.20 0.15 S sta 0.10 0.05 0 0 0.0020 0.0040 0.0060 0.0080 Ctg (M)

Para cada disolución patrón se determina la intensidad de la señal analítica obtenida según el método que se vaya a utilizar (por ejemplo, se determina la 5absorbancia en medidas espectrofotométricas).

Los valores obtenidos establecen los puntos de una función en la que:

• En el eje de abscisas (x): se representa la concentración.
• En el eje de ordenadas (y): se representa la señal medida.

Cuando analicemos nuestra muestra problema, la curva de calibración nos permite obtener su concentración extrapolando el valor de intensidad de señal obtenido en la medida.

En algunos aparatos, este proceso está automatizado, expresando el valor de concentración del analito directamente en un formato normalizado.

Controles en inmunoensayos

Con el objetivo de evitar errores que no puedan ser detectados por el aparato y que nos lleven a obtener unos resultados incorrectos se suelen introducir controles a la hora de realizar las mediciones.

Los controles son muestras que contienen concentraciones de analito conocidas. Monitorizan, así, la exactitud y la precisión del ensayo y también del analizador.

Normalmente se emplean dos tipos de controles:

• Control positivo: contiene una alta concentración de analito.
• Control negativo: contiene una concentración de analito muy baja o ausente.

Blanco de calibrado

Los blancos son soluciones que contienen todos los componentes de la disolución que se va a cuantificar excepto el analito problema.

De este modo, el blanco cuantifica la unión inespecífica producida en la reacción, resultado de la interacción del anticuerpo con otras moléculas presentes en la disolución que no son el antígeno (al que sí se une específicamente).

El valor obtenido se resta al resultado logrado en la medida de la mezcla completa.

Interpretación de los resultados

La presencia o la ausencia de un determinado analito depende del nivel al que interese detectarlo.

Hay casos en los que aunque el analito esté presente en muy baja concentración, es suficiente para determinar la prueba como positiva.

En otros casos, un analito determinado puede estar presente de forma natural en el cuerpo, pero solamente en los casos en los que su concentración aumente o disminuya mucho será indicatorio de algún tipo de patología.

Debido a esto, resulta necesario establecer un límite (punto de corte) a que nos ayude a distinguir entre un valor normal (negativo) o un valor alterado (positivo). Respuesta binaria.

Punto de corte

El punto de corte es un valor cuantitativo a partir del cual el resultado que se obtiene es positivo.

Sensibilildad Especificidad

Dependiendo de lo restringido que sea el punto de corte, para dar un resultado positivo, se calculan los parámetros de sensibilidad y especificidad del análisis.

• Un punto de corte muy alto, nos asegura que todos los valores por encima del son realmente positivos (específico). Pero puede dar como falso negativos a los positivos en los que el analito se encuentre a baja concentración (poco sensible). Cutoff Value Negative ; Positive Number of persons Healthy Disease True Negatives True Positives FNIFP "Abnormal Range" Lab Value or Clinical Measure FN=False Negative FP = False Positive
• "Normal Range" Un punto de corte muy bajo nos ? asegura que todos los que padezcan dicha enfermedad sea diagnosticados como positivos (sensible), pero también puede determinar como falsos positivos a individuos sanos (poco esico).pecíf

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