Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos en biología

Módulo III

¿De qué vamos a hablar?

• INTRODUCCIÓN
• CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
• PROPIEDADES FÍSICAS RELACIONADAS CON LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
• ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN Y OTRAS ENZIMAS ASOCIADAS A LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
• MUTACIONES Y POLIMORFISMOS
• TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ADN EN SANGRE PERIFÉRICA, BIOPSIAS Y TEJIDOS
• TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ARN

Introducción

• Mutación: Una mutación es un cambio en el material genético de un ser vivo, que puede ser heredado o adquirido. Las mutaciones pueden ser causadas por factores externos, como la radiación o las sustancias químicas, o pueden ser causadas por errores durante la replicación del ADN. Polimorfismo: El polimorfismo es la presencia de más de una forma de un gen en una población. Esto puede resultar en diferencias en la expresión de un rasgo en diferentes individuos.
• Desnaturalización: La desnaturalización es el proceso por el cual las proteínas pierden su estructura tridimensional y sus funciones, debido a un cambio en las condiciones ambientales, como la temperatura, la presión o la concentración de iones. . Exones: Los exones son secuencias de ADN que codifican para proteínas. Estas secuencias se transcriben en el ARN intermediario y luego se ensamblan para formar el ARN mensajero final. Los exones son los componentes del gen que codifican información funcional. Intrones: Los intrones son secuencias de ADN que se encuentran dentro de un gen y no codifican para proteínas. Estos son transcritos en el ARN intermediario, pero luego son cortados y eliminados antes de que se forme el ARN mensajero final.

Características estructurales y funcionales de los ácidos nucleicos

Timina Adenina extremo 5' O extremo 3' NH2 OH NH2 --- Q 0 ℃ -HN 0 N 0 H2N 0 H2N 0 Esqueleto desoxirribosa -fosfato H2N O NH2 OH extremo 3' Citosina 0 Guanina extremo 5 El ADN (Ácido Desoxirribonucleico) es una molécula larga, formada por la unión de dos cadenas de ácidos nucleicos. Estas cadenas se unen para formar una estructura en forma de hélice. Esta estructura es de doble hélice, en la cual cada una de las cadenas está compuesta de unidades de nucleótidos. Estas unidades son fosfato, azúcar y una base nitrogenada (adenina, guanina, citosina o timina).

Las bases nitrogenadas se pueden clasificar en:

• Púricas: Adenina y Guanina
• Pirimidínicas: Timina y Citocina, también Uracilo

El ARN (ácido ribonucleico) es un ácido nucleico y un polímero lineal que consiste en monómeros unidos entre sí con enlaces fosfodiester. Estas unidades monoméricas se conocen como nucleótidos, y su secuencia codifica la información genética. La estructura del ARN es similar a la del ADN, aunque es ligeramente más corta y más ligera. El ARN se compone de cuatro nucleótidos diferentes: adenina, citosina, guanina y uracilo. Estos nucleótidos se unen entre sí con enlaces fosfodiester para formar largas cadenas. La función principal del ARN es transferir la información genética desde el ADN a los ribosomas para la síntesis de proteínas. El ARN también desempeña un papel importante en la regulación de la expresión génica, así como en la regulación de otros procesos biológicos, como el desarrollo celular. El ARN también ayuda a controlar la replicación del ADN y la transcripción genética. Además, algunos tipos de ARN tienen una función enzimática, como el ARN ribozimas, que desempeña un papel importante en la regulación de la traducción proteica.

CITOSINA c NH Nucleótidos GUANINA G 0 NH N -NH2 N ADENINA A HUN N N N H n URACILO U 0 NH H Nucleótidos de ARN "esqueleto" ribosa-fosfato ARN (ácido ribonucléico)

Tipos de ARN

1. ARN mensajero (ARNm): Es el ARN que se transcribe a partir del ADN y es responsable de transportar la información genética para la síntesis de proteínas.
2. ARN ribosomal (ARNr): Es un ARN compuesto por varias subunidades que se unen para formar los ribosomas, los cuales son responsables de la síntesis de proteínas.
3. ARN transferido (ARNt): Es el ARN encargado de llevar los aminoácidos al ribosoma para que sean ensamblados para la síntesis de proteínas.
4. ARN de interferencia (ARNi): Es un tipo de ARN pequeño que se produce en el organismo para regular la expresión génica.
5. ARN no codificante (ARNnc): Son ARN que no se transcriben a partir de ADN y no codifican proteínas, pero son importantes para el desarrollo del organismo.

ARNm (ARN mensajero) ARNt (ARN de transferencia) ARNr (ARN ribosomal)

Procesos

ADN Usa un proceso llamado Transcripción Replicación · Traducción Para hacer maş idéntico ADN https://youtu.be/hsqgF7t8_Fw Genetica molecular. Replicación, transcripción ytradu ... Share Aminoácidos ___ REPLICACIÓN TRANSCRIPCIÓN. ČAU, D L Antico CAU O GAUGCUACCGUAN ARNm TRADUCCIÓN O Watch on YouTube Ribosoma Codón que ayudan con ARN que ayudan con El cual usa un proceso llamado Enzimas Traducción Las cuales puede ser proteínas reguladoras llamadas Para fabricar Proteínas Proteinas Estructurales Las cuales pueden ser Usa un proceso llamado Replicación · Transcripción - FASES Para fabricar que ayudan con

Transcripción Traducción AT GATCTCGTAA TACTAGAGCATT - ADN > AT GATCTCGTAA AUGAUCU ARN TACTAGAGCATT ADN > AUGAUCUCGUAA Transcrito (ARN) Met Ile Ser Polipéptido

Propiedades físicas relacionadas con las técnicas de biología molecular

• Los ácidos solubles son solubles en agua, presentan carácter polar. Son insolubles en disolventes orgánicos.
• La máxima estabilidad del ADN es a pH entre 4 y 7.
• La viscosidad es mayor en ADN que en ARN.
• La densidad es mayor en ARN que en ADN.
• Los ácidos nucleicos absorben luz ultravioleta, debido a las bases nitrogenadas.

Endonucleasas de restricción y otras enzimas asociadas a los ácidos nucleicos

• Endonucleasas de restricción Las endonucleasas de restricción son enzimas que se utilizan para cortar el ADN en una posición específica. Estas enzimas tienen la capacidad de reconocer una secuencia específica de nucleótidos y luego cortar el ADN en esa posición. Estas enzimas se utilizan en la ingeniería genética y la biología molecular para modificar secuencias de ADN específicas. Estas enzimas se utilizan para modificar los genes de organismos vivos, identificar patrones de secuencias de ADN, construir vectores de clonación y mucho más.
• ADN ligasas Las ADN ligasas son enzimas que se usan para unir dos cadenas de ADN. Estas enzimas se unen a una de las cadenas de ADN y luego unen la otra cadena de ADN a la primera. Esto se usa en muchos procesos biológicos, como en la reparación de ADN, la recombinación génica y la clonación. Las ADN ligasas son esenciales para muchos procesos importantes en la biología celular.
• ADN polimerasas Las ADN polimerasas son enzimas que catalizan la síntesis de ADN a partir de monómeros nucleotídicos. Estas enzimas se encuentran en todas las células eucariotas y en algunas células procariotas. Estas enzimas son capaces de replicar moléculas de ADN de forma fidelizada. Esto significa que las ADN polimerasas tienen la capacidad de reconocer y unir los monómeros nucleotídicos correctos en la cadena de ADN y mantener la integridad de la cadena durante la replicación. La ADN polimerasa puede replicar cadenas de ADN de hasta 1000 nucleótidos por minuto.
• Transcriptasa inversa o retrotranscriptasa Las transcriptasas inversas o retrotranscriptasas son enzimas que se utilizan para convertir ARN en ADN, un proceso conocido como transcripción inversa. Estas enzimas se encuentran en virus y en algunos organismos eucariotas y son esenciales para la replicación y la supervivencia de los virus. La retrotranscripción se utiliza también para producir copias de ADN a partir de ARNm en los organismos eucariotas, lo que permite la regulación de los genes. Además, las transcriptasas inversas también son herramientas útiles para la ingeniería genética.

Mutaciones y polimorfismos

CLASIFICACIÓN SENON LA EXTENSIÓN BEL MATERIAL THE NỀTHỂ QUE SE AFECTA N'UTACIONES GÉNICAS ALTERAN LA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DE UN GEN CROMOSÓMICAS SUSTITUCIÓN O DELECIÓN INSERCIÓN ( MODIFICAN LA ESTRUCTURA DEL CROMOSOMA TRANSICIÓN INVERSIÓN O DUPLICACIÓN TRANSLOCACIÓN DELECIÓN TRANSVERSIÓN PERICÉNTRICA PARACÉNTRICA RECÍPROCA + TRANSPOSICIÓN ANEUPLOIDÍAS MONOSOMÍAS ( SOMÁTICAS GERMINALES O ESPONTÁNEAS INDUCIDAS GENÓMICAS/ CARIOTÍPICAS VARIACIONES EN EL NÚMERO DE CROMOSOMAS EUPLOIDÍAS + POLIPLOIDÍA HAPLOIDÍA O + CLASIFICACIÓN SEGÚN LA CÉLULA QUE SE AFECTA CLASIFICACIÓN SEGÚN ORIGEN DE LA MUTACIÓN TRISOMÍAS O

Técnicas de extracción de ADN en sangre periférica, biopsias y tejidos

Muestras de las que se puede extraer ADN

Tejido fresco o congelado Bloques de parafina Plasma/suero Laminillas histológicas Saliva Sangre periférica con EDTA Sangre seca en Guthrie Cards Vellosidades corlónicas Líquido amniótico

Técnicas manuales

Técnica de extracción salina o salting-out . Tecnica del fenol-cloroformo- alcohol isoamílico

Técnicas automatizadas

Técnica de extracción salina o salting-out

Suero fisiológico Lavado de las células: suero fisiológico Lisis de leucocitos y digestión de proteinas Extracción salina NaCl Sat. Isopropanol TLL + Sol. Prot. K 0 Toda la noche a 37 ℃ -ADN Incubar en agitación Resuspender Proteínas Agitar Centrifugar Recoger el sobrenadante y centrifugar Precipita el ADN Agitar Centrifugar Descartar el sobrenadante STMT 0 HIELO 30 min 2ª vez: HIELO 5 min Conservación de la muestra: uso de reactivos EtOH y TE (tris-EDTA) Lavar con etanol Redisolver en tampón acuoso, que contiene el amortiguador. tris-EDTA Precipitación del ADN (hebras) Congelar a -20 ℃ Sangre Centrifugar 0 Descartar el sobrenadante . Lisis de eritrocitos:

Técnicas de extracción de ADN

• Técnica del tiocianato de guanidino/fenol/cloroformo 1. Añadir al tubo que contiene la fase de leucocitos: acetato de sodio + cloroformo + alcohol isoamílico 2. Agitar, incubar en hielo durante 15 minutos y centrifugar 3. Transferir la fase superior, fase acuosa donde se encuentra el ARN, a un nuevo tubo 4. Añadir isopropanol, incubar durante 1 hora a -20ª℃ y centrifugar 5. Desechar el sobrenadante 6. Añadir EtOH frío y resuspender el pellet 7. Repetir de nuevo los pasos 5 y 6 8. Centrifugar y descartar el sobrenadante 9. Dejar secar el pellet 10. Añadir agua estéril, vortear e incubar durante 10 minutos a 65ª℃ 11. Guardar a -20ª℃ Phase separation Isopropanol precipitation Aqueous phase Interphase Organic phase RNA Pellet