Extracción, Cuantificación y Purificación de Proteínas en Biología

Extracción, Cuantificación y Purificación de Proteínas

Ciclo: Laboratorio de Análisis y de Control de Calidad. Unidad de Trabajo 02: Extracción, Cuantificación y Purificación de Proteínas. Técnicas de Detección e Identificación de Proteínas. Bioinformática. Autora: Luisa Martínez Cervantes

1 .- Extracción, cuantificación y purificación de proteínas 1 1.1 .- Introducción 1 1.2 .- Métodos de rotura celular y extracción de proteínas 1 1.3 .- Métodos de cuantificación de proteínas 3 1.4 .- Técnicas de purificación de proteínas 6 1.5 .- Monitorización del proceso de purificación 14 2 .- Técnicas de detección e identificación de proteínas 15 2.1 .- Técnicas de detección serológicas o inmunológicas 15 2.2 .- Métodos de identificación 20 3 .- Bioinformática para proteínas 24

Extracción, Cuantificación y Purificación de Proteínas Biotecnológicas

Introducción a la Cuantificación de Proteínas

El conocimiento del proteoma, conjunto de proteínas de un organismo, ha pasado a ser el reto de la comunidad científica y de las empresas biotecnológicas, una vez que ya se ha completado la secuenciación del genoma de varios organismos incluyendo el genoma humano. El conocimiento de las secuencias de DNA que integran nuestros genes no tiene un gran valor, si no se identifica cuál es la función de dichos genes, en su caso, para qué proteínas codifican.

El programa proteoma busca la caracterización de todas las proteínas de la célula humana, identificando su secuencia de aminoácidos. Cuando se obtenga toda la secuencia de aminoácidos del proteoma humano se podrá relacionar mediante potentes programas informáticos la secuencia de aminoácidos de una proteína con el gen que la codifica. Los métodos de secuenciación tradicionales son demasiado lentos para abordar esta ingente tarea, la secuenciación de los péptidos debe hacerse por técnicas instrumentales. Naturalmente las técnicas de purificación y aislamiento de proteínas son esenciales para

Métodos de Rotura Celular y Extracción de Proteínas

El primer paso en cualquier proceso de purificación de proteínas debe ser, inevitablemente, la obtención de un extracto crudo. Las proteínas se encuentran en el interior de las células, por lo que inicialmente éstas deben romperse (lisis celular), para posteriormente poder extraer la proteína con un tampón adecuado. El método de rotura a elegir depende de las características mecánicas del tejido o células de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización. Entre los distintos métodos están: Página 1Ciclo: Laboratorio de Análisis y de Control de Calidad. Unidad de Trabajo 02: Extracción, Cuantificación y Purificación de Proteínas. Técnicas de Detección e Identificación de Proteínas. Bioinformática. Autora: Luisa Martínez Cervantes

Lisis osmótica. Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en suspender las células en una disolución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura.

Destrucción mecánica. Entre estos métodos se encuentran:

• La homogeneización, que consiste en hacer pasar las células entre un tubo y un pistón que ajustan casi totalmente.
• La dispersión con un homogeneizador eléctrico.
• La molienda en un mortero con arena o alúmina.
• La molienda en un mortero con nitrógeno líquido.
• La molienda con perlas de vidrio y vórtex, indicado para células microbianas.
• La molienda con una prensa, que hace pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio.
• La sonicación que consiste en someter las células a vibraciones de ultrasonido.

Congelación-descongelación. La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196°℃ (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente.

Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extracción para solubilizar las proteínas. Pueden utilizarse como tales, disoluciones acuosas de tampones específicos para proteínas solubles, o bien que contengan además detergentes si se pretende purificar proteínas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la proteína no se desnaturalice.

Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla. Los cambios bruscos de pH, ácidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la acción de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos) son los principales factores que pueden desnaturalizar las proteínas. Para evitar o minimizar estos factores la manipulación de las proteínas durante el proceso de purificación suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4°℃) y se procura que el proceso sea lo más corto posible, además en ocasiones es necesario añadir al tampón de extracción agentes protectores de grupos funcionales específicos de la proteína o bien inhibidores de proteasas.

El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogeneizado (homogenato u homogenado) que contiene una mezcla de proteínas, membranas y células rotas. Mediante centrifugación diferencial, se separan las distintas fracciones subcelulares del homogenato. Página 2Ciclo: Laboratorio de Análisis y de Control de Calidad. Unidad de Trabajo 02: Extracción, Cuantificación y Purificación de Proteínas. Técnicas de Detección e Identificación de Proteínas. Bioinformática. Autora: Luisa Martínez Cervantes

Por centrifugación (10000-15000 rpm) se eliminan los restos celulares, el sobrenadante, que contiene las proteínas solubles, se separa del precipitado que además de restos celulares también contienen proteínas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes. En cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente) constituye el extracto crudo donde se encuentra la proteína de interés objeto de la purificación. A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrífuga sea refrigerada. Los componentes se separan de acuerdo con el coeficiente de sedimentación y la densidad de los mismos.

Métodos de Cuantificación de Proteínas

Método Kjeldahl para Proteínas Biológicas

Es un método muy utilizado para la determinación de nitrógeno orgánico y amoniacal en todo tipo de muestras. Se aplica en la cuantificación de proteínas en alimentos. Se determinan valorando el nitrógeno total por el método de Kjeldahl y multiplicando por un factor que depende del producto analizado.

Todos los compuestos nitrogenados existentes en la muestra (aminoácidos, sales amónicas, aminas, etc.) se dan, en este método empírico y convencional, como proteínas.

El método Kjeldahl se basa en la destrucción de la materia orgánica, en medio fuertemente ácido y oxidante, de modo que todo el nitrógeno que contiene se transforma en sulfato amónico, y el carbono, hidrógeno y azufre son oxidados a dióxido de carbono, agua y dióxido de azufre.

El procedimiento sería el siguiente: unos mg de alimento se colocan en un matraz Kjeldahl con ácido sulfúrico concentrado. Se añaden además, sulfato potásico, para aumentar la temperatura de ebullición del ácido, y pequeñas cantidades de sulfato de cobre o selenio como catalizador. La mezcla se calienta a 360-380°C durante unas 3 horas, en vitrina, porque se desprenden grandes cantidades de trióxido de azufre y dióxido de azufre.

Para valorar este nitrógeno se alcaliniza con hidróxido sódico concentrado, y se destila el amoniaco formado, recogiéndose en una disolución medida de ácido (ácido clorhídrico o ácido sulfúrico), para valorar el exceso (valoración por retroceso) y calcular el consumido. También se puede recoger en ácido bórico (ácido débil) y valorar la base formada (valoración directa).

Reacciones: N (orgánico y amoniacal) + H2SO4 > (NH4)2SO4 (Digestión) NH+OH">NH3 (g) + H2O (Destilación) Página 3Ciclo: Laboratorio de Análisis y de Control de Calidad. Unidad de Trabajo 02: Extracción, Cuantificación y Purificación de Proteínas. Técnicas de Detección e Identificación de Proteínas. Bioinformática. Autora: Luisa Martínez Cervantes

NH3 + HCI > NH4Cl (Recogida amoniaco destilado) HClexceso + NaOH > NaCl + H2O (Titulación HCl en exceso) NH3 + H3BO3 > NHÀ + H2BO 3 (Recogida amoniaco destilado) H2BO3|+ HCI > H3BO3 + Cl (Titulación H2BO formado)

Métodos Aplicados en Bioquímica

La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

Método de Absorción con Luz Ultravioleta

Desarrollado en múltiples variantes. Se puede realizar a 280 nm (banda de aminoácidos aromáticos) o a 205 nm (banda del enlace péptido). A 280 nm la absorbancia dependerá de la cantidad de triptófano y tirosina presente en la proteína. La variabilidad en estos aminoácidos en diferentes proteínas obliga a añadir un factor de corrección aportado por la absorbancia del enlace peptídico a 205 nm. La concentración se puede obtener aplicando la siguiente expresión:

1205 27+120 x A, A 280 205

Los ácidos nucleicos pueden absorber a 280, por lo que hay que corregir leyendo a 260 nm (absorbancia máxima de los ácidos nucleicos). Si se conoce la corrección en la absorción se puede calcular la concentración de proteínas:

Proteína (mg/ml) = 1,55 x A280 - 0,76 x A260 Página 4Ciclo: Laboratorio de Análisis y de Control de Calidad. Unidad de Trabajo 02: Extracción, Cuantificación y Purificación de Proteínas. Técnicas de Detección e Identificación de Proteínas. Bioinformática. Autora: Luisa Martínez Cervantes

0.5 DNA 0.4 ABSORPTION 0.3 0.2 PROTEIN 0.1 220 240 260 280 300 WAVE LENGTH /MAL

Método Biuret

Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el cobre (II) y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. Un Cu (II) se compleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y solo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero). El máximo de absorción del complejo proteína-Biuret se produce a 545 nm.

1 NH NH NH R-CH R-CH CH-R + Cu++ Cu+ O=C O=C. C=O NH ZI A

Tiene la ventaja de ser extremadamente sensible. Cuando tratamos con mezclas biológicas complejas, podemos calibrar con alguna proteína comercial, como es la seroalbúmina bovina.

La reacción que tiene lugar en el método Lowry es bastante compleja y no del todo conocida. Se desarrolla en las siguientes fases:

1 .- Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones cobre (II), en presencia de tartrato para evitar la precipitación. Es esencialmente idéntica a la reacción Biuret, formándose un complejo de coordinación entre el cobre y el nitrógeno peptídico. Página 5 ishechológicos