Controllo della crescita microbica: finalità, metodi e resistenza agli antibiotici

Controllo della Crescita Microbica

Lo sviluppo dei microrganismi può comportare, oltre effetti positivi, conseguenze negative, dovute alle specie patogene (patogenicità) e all'azione dei microrganismi sui materiali in cui crescono (bio deterioramento). Esse si basano su diverse proprietà che hanno i microrganismi:

• patogeni: svolgendo il ciclo vitale e l'azione negativa all'interno di altri organismi viventi, possiedono strutture per aderire ai tessuti dell'ospite e penetrare al suo interno. Adattandosi all'ambiente dell'ospite, hanno perso o ridotto la capacità di svilupparsi alle condizioni variabili del mondo esterno.
• microrganismi alterativi: vivono all'esterno, hanno evoluto meccanismi per sopravvivere ai differenti fattori ambientali, nutrendosi dei composti chimici presenti negli oggetti contaminati.

Anche sul piano sociale hanno impatti diversi. Se, l'azione alterativa dei microrganismi comporta danni di natura economica, l'azione patogena si riflette su altri aspetti come, sul costo della spesa sanitaria o sul settore zootecnico o agricolo, ma anche sul benessere del singolo individuo e della collettività.

Finalità del Controllo Microbico

Sono indispensabili sistemi di controllo che abbiano come obiettivo il contenimento o l'eliminazione delle specie microbiche indesiderate. Poiché è impossibile eliminare in modo definitivo tutte le specie dannose, occorre evitare la diffusione delle forme patogene e prevenirne lo sviluppo. Rientrano in questi obiettivi tecniche come la sterilizzazione, la pastorizzazione, ma anche comportamenti comuni, come il lavarsi le mani e la disinfezione delle ferite. Le attività che si svolgono nei laboratori di microbiologia richiedono il controllo dei microrganismi, in quanto specie estranee al campione, possono interferire modificando i risultati delle analisi. Eliminare i microrganismi significa impedirne la crescita. Ciò è possibile agendo a due livelli:

• inibire la riproduzione cellulare: le cellule rimangono vitali e conservano, se ritrovano un ambiente favorevole, la possibilità di riprodursi.
• uccidere i microrganismi: le cellule muoiono, perdendo irreversibilmente la capacità di moltiplicarsi.

Per distinguere i metodi che uccidono i microrganismi da quelli basati sull'inibizione della crescita si utilizza una terminologia specifica, ad esempio germicida (agente chimico o fisico che uccide i microrganismi) e germostatico (agente chimico o fisico che provoca l'arresto della crescita microbica). l'eliminazione dei microrganismi può essere ottenuta anche per rimozione, allontanandoli dall'oggetto che interessa senza interferire con la loro vitalità e possibilità di riprodursi. La rimozione può essere fatta manualmente o mediante strumenti specifici, quali i sistemi di filtrazione dell'aria, adottati in diverse produzioni industriali.

Scelta dei Metodi di Controllo

I mezzi utilizzati contro i microrganismi sono classificati, in fisici e chimici. Anche i processi biologici possono inibire la crescita di specie indesiderate. Nella produzione dello yogurt, l'acidità creata dalla fermentazione del latte previene la crescita dei batteri alterativi. Poiché non esiste un agente antimicrobico che possa essere ritenuto ideale, la scelta del metodo da adottare per l'eliminazione dei microrganismi dipende dalla valutazione di una serie di elementi, quali:

• obiettivi dell'azione di controllo: uccidere tutte le forme microbiche per avere condizione di sicura sterilità.
• natura dei microrganismi contaminanti: la sensibilità dei microrganismi agli agenti antimicrobici varia a seconda della specie, dello stato fisiologico e della presenza di forme di resistenza. I microrganismi che si trovano in fase di crescita esponenziale sono in genere più sensibili, rispetto alle cellule "vecchie", ai vari agenti antimicrobici. le spore batteriche sono quelle che sopravvivono maggiormente.
• mezzo in cui si trovano i microrganismi: il materiale che ospita i microrganismi, condiziona:
  • l'efficacia del trattamento: i microrganismi che contaminano uno strato vicini alla neutralità, sono più resistenti al calore che in mezzi acidi o basici. la presenza di materia organica, grassi e proteine, li protegge.
  • le opportunità d'impiego: le alte temperature possono degradare i fattori nutritivi presenti negli alimenti.
• modalità d'azione dell'agente antimicrobico: non per tutti gli agenti antimicrobici si conosce il sito cellulare che per primo viene danneggiato, in quanto l'effetto letale è spesso la conseguenza di una serie di cambiamenti che alterano l'equilibrio cellulare.

Le strutture microbiche maggiormente esposte a danni irreversibili sono quelle la cui integrità condiziona lo svolgimento delle funzioni vitali: parete e membrana, proteine ed enzimi, acidi nucleici. La disintegrazione della parete espone i batteri, alla lisi. L'alterazione della membrana comporta cambiamenti nella permeabilità e nell'attività biochimica, poiché molti complessi enzimatici, sono localizzati proprio a livello della membrana. La denaturazione delle proteine, cioè la perdita della loro capacità funzionale ed i danni agli acidi nucleici possono determinare mutazioni o bloccare le normali attività del DNA e dell'RNA. In relazione all'azione degli antimicrobici occorre tenere presente che molti di essi, possono danneggiare i materiali da decontaminare ed essere nocivi all'uomo e agli altri sistemi viventi.

Fattori Fisici (Agenti Antimicrobici)

Alte Temperature

L'agente fisico più comunemente impiegato per eliminare i microrganismi è il calore, sia perché può garantire la sterilizzazione dei materiali sia per la semplicità ed economicità del suo impiego. L'utilizzo del calore è, presente in microbiologia, in campo sanitario, in processi industriali, nel settore alimentare e farmaceutico. I microrganismi hanno diversa sensibilità al calore, essa e l'efficacia dei trattamenti termici sono valutati attraverso 3 parametri:

• punto di morte termica: la temperatura minima per uccidere una sospensione di cellule in 10 minuti.
• tempo di morte termica: il più breve intervallo di tempo necessario per uccidere una sospensione microbica a una determinata temperatura e in condizioni prefissate.
• il tempo di riduzione decimale (valore D): indica il tempo, in minuti, richiesto per ridurre di 10 volte una popolazione, cioè per distruggere il 90% degli organismi presenti. Esso è utilizzato nell'industria alimentare.

Il tipo di calore impiegato per eliminare i microrganismi può essere:

• il calore umido: sotto forma di acqua e vapore acqueo. Esso agisce più rapidamente, in quanto la presenza di acqua accelera la rotture dei legami dei legami chimici e di conseguenza la denaturazione delle proteine.
• il calore secco: riscaldamento alla fiamma o attraverso aria calda. sterilizzazione ha temperature più elevate.

La resistenza dei microrganismi, dipende da vari fattori: età, presenza di forme di resistenza, la composizione chimica e PH del mezzo. (nutrienti adeguati aumentano la resistenza e con PH tra 6-8).

Sterilizzazione in Autoclave

Sterilizzazione in autoclave: si basa sull'utilizzo di vapore sotto pressione ed apparecchi a chiusura ermetica da cui il vapore, prodotto dall'acqua riscaldata, non può uscire. All'aumentare della press. all'interno dell'apparecchio, aumenta la temp. Il vapore sotto pressione è un buon conduttore di calore ed uccide i microrganismi attraverso la denaturazione delle proteine. Il vapore deve essere in grado di penetrare in tutte le zone del materiale da trattare. La sterilizzazione in autoclave viene solitamente effettuata ad una temp. di 121℃ per 15 min. (con pressione 1atm.) condizione nelle quali vengono uccise le spore batteriche. Fasi di funzionamento: rimozione dell'acqua della camera di sterilizzazione, la saturazione della camera con il vapore acqueo, il raggiungimento della temp. voluta e la sterilizzazione per il tempo prestabilito. Per evitare ustioni, è necessario aprire l'autoclave solo dopo che esso ha raggiunto al suo interno, i valori della pressione atmosferica. Va inoltre evitato l'eccessivo raffreddamento dell'apparecchio così da evitare inconvenienti provocati dall'aumento di pressione a causa dell'ingresso dell'aria. Per valutare se la sterilizzazione è avvenuta con successo ci possiamo basare su due metodi:

• Funzionamento autoclave: si aggiunge indicatori che cambiano colore arrivati a press. e temp. richieste
• Efficacia trattamento di sterilizzazione: si aggiunge ai materiali da sterilizzare una fiala di indicatori biologici

Viene poi realizzato un terreno idoneo per la crescita, il quale andrà in incubazione, al termine di quest'ultimo, se il terreno non ha sviluppo forme di crescita allora la sterilizzazione sarà avvenuta con successo. utilizzato: per sterilizzare terreni di coltura soluzioni, vetreria (non per materiali termolabili = il calore li altera).

Ebollizione e Vapore Fluente

Ebollizione e vapore fluente: l'ebollizione si realizza attraverso l'immersione in acqua bollente dei materiali da trattare. Operando a circa 100℃, porta alla distruzione di molte forme vegetative, tranne per quelle più resistenti (spore batteriche), esse hanno bisogno di un trattamento prolungato. Spesso l'ebollizione non assicura la sterilità. Il calore umido può essere ottenuto anche attraverso vapore fluente, utilizzando ad esempio l'autoclave senza chiuderlo ermeticamente così da evitare l'aumento di pressione. I trattamenti termici vengono solitamente prolungati per 30-60 minuti.

Tindalizzazione

Tindalizzazione: è un metodo di sterilizzazione frazionata. Essa è suddivisa in più passaggi: un primo trattamento termico uccide le forme vegetative, poi si ha un periodo di incubazione di 24 ore, così da favorire la germinazione delle spore, poi il materiale ottenuto viene riportato a temperature di 80-100℃ per 30 minuti, con il fine di uccidere le cellule vegetative originatesi in precedenza. Utilizzo: è usata per sostanze che non sopportano le alte temperature (terreni di coltura) ma non è indicata per materiali come oggetti metallici o vetreria.

Pastorizzazione

Pastorizzazione: fu utilizzata da Pasteur per eliminare i microrganismi responsabili delle alterazioni del vino e della birra, è un metodo basato sul calore umido che si svolge a temperature inferiori ai 100 ℃. Non consente, la sterilizzazione bensì l'eliminazione della maggior parte dei microrganismi e soprattutto dei germi patogeni. Può essere praticata con modalità diverse come quelle tradizionali a 63 ℃ per 30 minuti a quelle cosiddette a flash o ad alta pastorizzazione, in cui si applicano temperature più elevate ma per tempi inferiori, come 72 ℃ per 15 secondi. Questa soluzione consente di preservare maggiormente le caratteristiche nutritive e organolettiche del prodotto trattato. viene utilizzata soprattutto nel settore alimentare per uccidere gran parte dei germi patogeni di alimenti facilmente deperibili (latte) tuttavia alla pastorizzazione sopravvivono, oltre alle spore batteriche, alcune specie non patogene quali i batteri termodurici o termoresistenti.

Sterilizzazione con Calore Secco

Sterilizzazione con calore secco: si realizza in stufe a circolazione di aria calda operando, per eliminare le spore e altre forme vegetative, a temperature di 160-170 ℃ per 2 ore. Si ritiene che essa mostri la propria azione attraverso l'ossidazione dei composti cellulari. Il calore secco è generalmente utilizzato per sterilizzare contenitori di vetro, oggetti metallici o materiali in polvere. Non è invece adatto per materiali termolabili, quali plastica e gomma. Anche l'arroventamento dell'ansa alla fiamma del Bunsen è una forma di sterilizzazione a secco e sullo stesso principio si basa l'incenerimento in forni di oggetti contaminati come i materiali di medicazione e le carcasse di animali infetti.

Basse Temperature

basse temperature : Non uccidono i microrganismi ma ne inibiscono la crescita, riducendo l'attività metabolica e diminuendo, a seguito del congelamento, la disponibilità d'acqua. L'azione battericida può provocare la formazione all'interno delle cellule di cristalli di ghiaccio che, provocando aumento di volume, causano la rottura della membrana. Le basse temperature sono utilizzate nella conservazione dei prodotti facilmente deteriorabili, come gli alimenti (carne, pesce), farmaci, vaccini e diagnostici di laboratorio. Anche il mantenimento dei ceppi microbici è effettuato a basse temperature, allo scopo di evitare i continui trapianti in terreno fresco che sarebbero necessari se la crescita non fosse bloccata. I due sistemi che impiegano le basse temperature sono:

Refrigerazione

Refrigerazione: si applicano temperature comprese tra 0 e +5 ℃. A tali condizioni crescono, seppur lentamente, sia le specie psicrofile sia alcuni ceppi patogeni, che possono contaminare gli alimenti. L'effetto batterio-statico della refrigerazione è, pertanto, solo parziale e la conservazione degli alimenti e dei prodotti deteriorabili è limitata nel tempo.

Congelamento

Congelamento: la temperatura viene abbassata fino a raggiungere anche -70, -80 ℃; esso è adatto per la conservazione delle sostanze per lunghi periodi di tempo. Poiché viene applicato soprattutto nel settore alimentare, è importante ricordare che gli effetti del congelamento sono germo-statici, per cui un alimento scongelato non va conservato ma cotto e consumato per evitare il deterioramento e anche l'eventuale crescita di patogeni. In base alla velocità di congelamento si ha la distinzione fra:

• congelamento lento: la temperatura, è raggiunta in diverse ore. è quindi più nocivo per i microrganismi in quanto sono presenti grossi cristalli di ghiaccio che rompono più facilmente le strutture cellulari.